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1. WO2020135344 - APPLICATION OF HUMAN ENDOMETRIUM ENDOTHELIAL PROJENITOR CELLS IN IMPROVING CARDIOMYOCYTE DAMAGE

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说明书

发明名称

技术领域

0001  

背景技术

0002   0003   0004   0005   0006  

发明概述

技术问题

0007  

技术解决方案

0008   0009   0010   0011   0012   0013  

有益效果

0014   0015   0016  

附图说明

0017   0018   0019   0020  

本发明的实施方式

0021   0022   0023   0024   0025   0026   0027   0028   0029   0030   0031   0032   0033   0034   0035   0036   0037   0038   0039   0040   0041   0042   0043   0044   0045   0046   0047   0048   0049   0050   0051   0052   0053   0054   0055   0056   0057   0058   0059   0060   0061  

权利要求书

1   2   3   4  

附图

页1 

说明书

发明名称 : 人子宫内膜内皮祖细胞在改善损伤心肌细胞上的应用

技术领域

技术领域

[0001]
本发明涉及一种内皮祖细胞,特别是一种人体子宫内膜来源的内皮祖细胞。本发明的人子宫内膜内皮祖细胞能够改善损伤心肌细胞的活性和功能,从而可以更好地修复因心肌细胞功能障碍所致的心脏疾病。

背景技术

背景技术

[0002]
随着老龄化社会的到来及城市化进程的加快,人们不健康生活方式的流行,冠状动脉粥样硬化性心脏病的发病率和死亡率呈现持续增长的趋势。根据《2017中国心血管病报道》显示,我国冠心病患病人数达到1100万,占居民疾病死亡构成的40%。冠状动脉粥样硬化性心脏病是指因心脏血液灌注减少,导致心脏供氧下降,心肌能量代谢发生异常,所产生的能量不足以维持心脏正常运行的一种病理状态,最终导致心力衰竭。
[0003]
干细胞/祖细胞是一种具有自我复制、更新和多向分化潜能的细胞,具有修复受损组织细胞的潜能,近年来已成为疾病治疗和组织工程领域理想的种子细胞,是各种疾病尤其是各种难治性疾病可能的新的有效治疗方法。
[0004]
近些年来,随着再生医学的迅猛发展,干细胞移植修复损伤心肌细胞已成为心血管系统疾病最有前景的治疗方法。而在治疗中,心肌功能的重塑最为关键,其需要多个环节一起发挥作用,如心肌细胞活性的改善、心肌细胞能量代谢的改善以及心肌纤维化的改善等。
[0005]
通过再生医学能够达到有效改善损伤心肌活性和功能的理想种子细胞,除了应具有增殖能力强,分化良好,免疫原性低,容易获取以及分泌能力强大等特点外,最主要的是应该具有强的成血管能力。
[0006]
201810930216.6专利申请涉及了一种人子宫内膜组织来源内皮祖细胞的分离培养方法,其从人子宫内膜组织中分离培养得到一种具有强修复再生能力的人子宫内膜内皮祖细胞,并证明该内皮祖细胞具有更强的增殖能力,即具有更强的活力,具备快速获得更多种子细胞的能力。

发明概述

技术问题

[0007]
本发明的目的是提供人子宫内膜内皮祖细胞在改善损伤心肌细胞上的应用。

技术解决方案

[0008]
发明人通过小鼠研究显示,结扎小鼠左冠状动脉后,小鼠的子宫细胞归巢到心肌损伤区参与心肌细胞修复并改善心功能,以及子宫源性的细胞能显著增加血管形成。因此,在人体子宫中存在具有强修复再生能力的干细胞。
[0009]
发明人已经从人体的子宫内膜组织中分离培养出人子宫内膜内皮祖细胞。本发明进一步验证了这种人子宫内膜内皮祖细胞具有更强的成血管能力,可以更好的改善损伤心肌细胞活性、改善损伤心肌能量代谢及纤维化程度。
[0010]
基于此,本发明将所培养得到的人子宫内膜内皮祖细胞作为改善损伤心肌细胞的药物进行应用。
[0011]
具体地,本发明是将培养出的人子宫内膜内皮祖细胞用PBS重悬后,混匀制成用于改善损伤心肌细胞的人子宫内膜内皮祖细胞制剂。
[0012]
更具体地,本发明是采用培养出的P2~P6代人子宫内膜内皮祖细胞制备所述人子宫内膜内皮祖细胞制剂。
[0013]
本发明所制备的人子宫内膜内皮祖细胞制剂中,优选每1ml干细胞制剂中含有(3~7)×10 7个人子宫内膜内皮祖细胞。

有益效果

[0014]
本发明通过在体实验进行了上述人子宫内膜内皮祖细胞制剂改善损伤心肌细胞活性和功能的验证研究。
[0015]
将人子宫内膜内皮祖细胞与Matrigel基质胶混合均匀后,皮下注射至小鼠右侧腹股沟处,7天后取出Matrigel Plug,切片进行HE染色观察新生血管情况,通过在体实验证明了人子宫内膜内皮祖细胞具有成血管能力。
[0016]
结扎裸大鼠冠状动脉左前降支进行造模后,心肌损伤局部注射人子宫内膜内皮祖细胞制剂,通过心脏彩超观察心功能变化、PET-CT观察心肌细胞活性及能量代谢、Masson染色观察纤维化程度,在体实验证明人子宫内膜内皮祖细胞制剂可以通过更好的改善损伤心肌细胞活性、能量代谢及纤维化程度,起到更好的修复损伤心肌的作用。

附图说明

[0017]
图1是Matrigel Plug观察人子宫内膜内皮祖细胞的成血管能力效果图。
[0018]
图2是超声心动图评估各组造模前后裸大鼠的左室心功能变化结果。
[0019]
图3是PET-CT评估各组造模前后裸大鼠的心肌细胞活性和能量代谢效果。
[0020]
图4是Masson三色染色后显示各组裸大鼠治疗后损伤心肌区的纤维化变化情况。

本发明的实施方式

[0021]
下述实施例仅为本发明的优选技术方案,并不用于对本发明进行任何限制。对于本领域技术人员而言,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
[0022]
实施例1:制备人子宫内膜内皮祖细胞制剂。
[0023]
将人子宫内膜内皮祖细胞(EPCs)用含1%青链霉素的10% FBS-EGM2培养基进行培养,培养瓶放入37℃,5% CO 2培养箱中,每2~3天更换培养基。待细胞融合达到80~90%时,0.05%胰蛋白酶溶液(含0.02%EDTA)消化,以1∶3的比例传代,得到第1代人子宫内膜内皮祖细胞,记为P1。重复上次操作,制备得到P2~P6代人子宫内膜内皮祖细胞。
[0024]
选取生长状态良好的P2~P6代细胞,细胞融合达到80~90%时,用PBS缓冲液冲洗3遍,洗干净FBS后,加入0.05%胰蛋白酶溶液(含0.02%EDTA)消化3~4min,显微镜下观察细胞变圆,加入10% FBS-DMEM/F12终止消化,吸入15ml离心管中离心,弃上清保留细胞团。
[0025]
将所得细胞团用PBS液清洗残留血清后,用PBS液以(3~7)×10 7/ml的浓度重悬,制备得到(3~7)×10 6/100µl的人子宫内膜内皮祖细胞制剂。
[0026]
以上制备人子宫内膜内皮祖细胞制剂的所有操作均在无菌操作台中操作,并且在制作、运输、使用中均执行无菌操作原则。
[0027]
实施例2:人子宫内膜内皮祖细胞的Matrigel Plug实验。
[0028]
将Matrigel基质胶置于4℃冰箱内过夜,融化为液体状态。加样的枪头、注射器、EP管在-20℃冰箱过夜,保持低温。
[0029]
取融合至80~90%的人子宫内膜内皮祖细胞,以0.05%胰蛋白酶溶液(含0.02%EDTA)消化,制备细胞悬液。细胞计数,将细胞悬液制备成1×10 6/ml,以5×10 5个细胞与50µl的Matrigel基质胶混合均匀,所有操作均在冰上进行。
[0030]
将5ml注射器针头连接到lml注射器上,用于Matrigel与细胞混合物的注射。将混合物皮下注射至裸小鼠右侧腹股沟处,每组注射3只。另设空白组,注射Matrigel与PBS的混合物。
[0031]
7天后,取出Matrigel Plug,切片进行HE染色,观察新生血管情况。结果见图1,图中管状结构数量越多,提示成血管能力越强。
[0032]
图1中A为EPCs+Matrigel结节,肉眼观察其体积较大,颜色发红,且结节内可见血管。B为PBS+Matrigel结节,肉眼可看到体积偏小,较为透明,结节内血管不明显。C为EPCs+Matrigel结节的HE染色效果,可见有新生血管形成,且管腔完整。D为PBS+Matrigel结节的HE染色效果,未见新生管腔。
[0033]
Matrigel Plug实验结果显示,人子宫内膜内皮祖细胞具有强的成血管能力。
[0034]
实施例3:人子宫内膜内皮祖细胞修复损伤心肌的实验。
[0035]
结扎裸大鼠冠状动脉左前降支造模,1周后损伤心肌局部组织注射人子宫内膜内皮祖细胞治疗心肌梗死。
[0036]
取200~250g裸大鼠,手术前电推备皮,3%异氟烷混合氧气吸入全身麻醉。
[0037]
麻醉充分后,将裸大鼠用18G静脉留置针行气管插管,连接小动物呼吸机V8S辅助机械通气,潮气量5~7ml,频率75次/min。仰卧位固定四肢于铺有37℃恒温垫的手术台上,术野皮肤用75%酒精消毒,剪开皮肤、皮下、肌层等逐层开胸,沿左腋前线剪断第3、 4肋骨,盐水纱布挡住肺组织,沿心底剪开心包,分离心包后暴露心脏。在肺动脉圆锥与左心耳根部之间找到粉红色走行的冠状动脉前降支,在左心耳下缘3~5mm处用7/0圆针尼龙线结扎左前降支冠脉,深度1~2mm,宽度3mm。损伤心肌呈现苍白,运动减弱,提示造模成功。
[0038]
造模成功后,用3/0尼龙缝线逐层缝合关闭胸腔。拔出气管插管前,皮下注射长效青霉素150000U/kg。密切观察裸大鼠反应,待裸大鼠出现较强自主呼吸并试图自行脱离呼吸机时给予氧气吸入。观察到呼吸、心率相对平稳时拔除气管插管。
[0039]
将造模完成的裸大鼠置于37℃恒温垫复温30min,放单独笼中观察,待完全自由活动后归入大笼。
[0040]
1周后超声心动检测,挑选符合入选条件的裸大鼠18只,随机分成实验组、对照组和空白组,进入下一步实验。
[0041]
重复上述造模的开胸步骤,所有裸大鼠均选取3个注射点,损伤心肌边界区2个,损伤心肌中央区1个。以胰岛素注射器在上述3个位置心肌局部注射60µl(1.8~4.2×10 6个细胞)干细胞制剂。其中实验组注射人子宫内膜内皮祖细胞制剂,对照组注射人骨髓间充质干细胞制剂,空白组注射等体积PBS液。注射结束后,重复造模关闭胸腔步骤。
[0042]
实施例4:超声心动图检测各组造模裸大鼠的心功能变化。
[0043]
裸大鼠造模前、后1周,移植干细胞制剂后1、2周,使用超声心动图评估裸大鼠的心功能情况,并筛选造模成功裸大鼠。
[0044]
2.0%异氟烷混合氧气诱导麻醉裸大鼠,剔除正中毛,取仰卧位置于37℃远红外恒温垫上,鼻罩持续吸入异氟烷混合氧气。
[0045]
超声心动图探头取长轴和短轴B超图像及短轴M超图像,超声记录分析左心室收缩末期内径(LVIDs)及左心室舒张末期内径(LVIDd),由超声机自动计算左室射血分数(EF)、左室短轴缩短率(FS)。
[0046]
典型造模成功裸大鼠1周后表现为左室前壁部分室壁变薄,左室短轴切面显示左室前壁、前间壁心肌结构消失,回声增强,运动幅度减低或消失。
[0047]
造模成功进入细胞移植实验的标准为:客观指标FS<30%,EF<60%;主观指标判断至少有一个层面的前壁室壁收缩运动明显异常。同时符合两个指标者入选进入下一步实验。
[0048]
图2中A为LVIDd,表示左心室舒张末期内径,B为LVIDs,表示左心室收缩末期内径,C为EF,表示射血分数,D为FS,表示左室短轴缩短率。
[0049]
如果造模后裸大鼠的即刻实验结果显示FS<30%,EF<60%,则提示造模成功。
[0050]
随着时间的延长,实验组和对照组的LVIDd、LVIDs值较造模后逐渐减小,EF、FS较造模后逐渐升高,而空白组无明显改善。同时,实验组较对照组的升高明显,且随着时间的延长,这种差异更加明显。
[0051]
上述实验结论证明,细胞移植可以明显改善损伤心脏心功能,人子宫内皮祖细胞较人骨髓间充质干细胞的改善效果更佳。
[0052]
实施例5:PET-CT评估各组造模裸大鼠的心肌细胞活性、能量代谢。
[0053]
分别在裸大鼠造模前、后1周,及移植祖细胞制剂后2周,采用PET-CT观察细胞移植对心肌梗死区域葡萄糖代谢的影响,从而反应其心肌细胞活性和心肌细胞能量代谢情况。
[0054]
将各组裸大鼠2.0%异氟烷混合氧气诱导麻醉,尾静脉注射 18F-FDG 6MBq/只,40min后置于37℃恒温Minerve小动物舱,以保持动物恒温,放置在Mico-PET/CT扫描床,选择颈部至上腹部行PET-CT扫描采集成像,期间使用2.0%异氟烷混合氧气维持麻醉。
[0055]
采用基于蒙特卡洛系统模型的3D Order Subsets Expectation Maximization(OSEM)算法进行图像重建。设定采集时间20min,同位素选择F-18,其余参数均选择系统默认。采集完成后,在弹出对话框内输入放射性药物剂量及测量时间,由系统自动完成重建。数据重建先选择滤波反投影法,然后用二维有序子集最大期望值法再次图像重建。采用PMOD软件进行图像分析。
[0056]
图3的实验结果显示,空白组(PBS)梗死区域心肌代谢活度明显减低,FDG摄取量明显减低;而细胞移植后可以改善梗死区域心肌代谢活动度,改善梗死区域心肌对FDG的摄取,且实验组改善效果更为明显。提示人子宫内膜内皮祖细胞移植可以改善损伤心肌的细胞活性和能量代谢,从而促进损伤心肌的修复。
[0057]
实施例6:Masson三色染色检测各组造模裸大鼠的心肌细胞纤维化情况。
[0058]
细胞移植后第4周末,前述实验结束后,在异氟烷混合氧气诱导麻醉状态下,静脉注射心脏骤停液处死所有裸大鼠。
[0059]
取出心脏,取出左心室左前降支供应区域的损伤心肌,置于多聚甲醛浸泡固定,24h后取出,脱水、透明、浸蜡、包埋、切片。
[0060]
将组织切片以二甲苯脱蜡、梯度酒精脱水后,置于Bouin液中固定,水洗干净。顺序以Weiger's working solution(A+B=1∶1)染黑色,水洗干净;Biebrich染红色,水洗,P/P Acid处理;Methly Blue染蓝色,水洗。最后分别以1%冰醋酸洗,水洗,酒精梯度脱水后,二甲苯透明,中性树胶封片。置于通风橱中风干过夜,拍照扫片,评估各组损伤心肌区的纤维化程度。
[0061]
图4给出了Masson三色染色后的扫描图片,图中蓝色区为纤维组织,代表纤维化情况。结果显示,实验组移植人子宫内皮祖细胞(EPCs)后蓝色区域面积减少,而空白组移植PBS的蓝色区域面积大,提示人子宫内膜内皮祖细胞移植的心脏纤维化程度明显减轻。

权利要求书

[权利要求 1]
人子宫内膜内皮祖细胞制剂作为改善损伤心肌细胞的药物的应用。
[权利要求 2]
根据权利要求1所述的应用,是将人子宫内膜内皮祖细胞用PBS重悬,混匀制成用于改善损伤心肌细胞的人子宫内膜内皮祖细胞制剂。
[权利要求 3]
根据权利要求1或2所述的应用,其特征是所述人子宫内膜内皮祖细胞为培养的P2~P6代人子宫内膜内皮祖细胞。
[权利要求 4]
根据权利要求2所述的应用,其特征是每1ml干细胞制剂中含有(3~7)×10 7个人子宫内膜内皮祖细胞。

附图