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1. WO2020127604 - IN-VITRO-VERFAHREN ZUM NACHWEIS VON MINDESTENS EINER NUKLEINSÄURE, DIE SICH BEI EINEM LEBEWESEN IM VOLLBLUT AUßERHALB DER BLUTZELLEN BEFINDET UND VOR-RICHTUNG UND KIT HIERZU

Anmerkung: Text basiert auf automatischer optischer Zeichenerkennung (OCR). Verwenden Sie bitte aus rechtlichen Gründen die PDF-Version.

[ DE ]

Patentansprüche

1. tn-vitro-M erfahren zum Nachweis von mindestens einer Nukleinsäure, die sich bei einem Lebewesen im Vollblut außerhalb der Blutzellen be findet, umfassend die Schritte

a) Bereitstellen einer Reaktionsmischung, die zusammen mit mindes tens einem Primerpaar zur Durchführung einer isothermalen Amp lifikationsreaktion geeignet ist, wobei die Reaktionsmischung min destens ein Primerpaar enthält, das zur Amplifikation von mindes tens einer im Vollblut befindlichen Nukleinsäure geeignet ist oder mindestens ein solches Primerpaar der Reaktionsmischung zuge geben wird;

b) Zugabe von Vollblut eines Lebewesens zu der Reaktionsmischung; c) Durchführen einer isothermalen Amplifikationsreaktion bei einer Temperatur im Bereich von < 45 °C; und

d) Detektion von DNA mithilfe von mindestens einem Detektionsrea genz, wobei die Detektion während Schritt c) oder nach Schritt c) durchgeführt wird;

dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionsmischung dazu geeignet ist, eine Lyse von Blutzellen, die bei dem Lebewesen im Vollblut ent halten sind, zu verhindern.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Reak tionsmischung

i) mit dem Vollblut eine flüssige Mischung bildet, die im Wesentli chen isotonisch mit Blutzellen ist; und/oder

ii) mit dem Vollblut eine flüssige Mischung bildet, die eine

Osmolarität aufweist, welche im Wesentlichen der Osmolarität von Blutzellen entspricht, bevorzugt eine Osmolarität im Bereich von 230 bis 350 mosmol/kg, bevorzugt 260 bis 320 mosmol/kg,

besonders bevorzugt 270 bis BIO mosmol/kg, insbesondere 280 bis 300 mosmol/kg; und/oder

iii) keine Tenside enthält, die dazu geeignet sind, eine Lyse von Blut zellen zu bewirken, bevorzugt keine Stoffe oder Stoffgemische enthält, die dazu geeignet sind, eine Lyse von Blutzellen zu bewir ken.

3. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch ge kennzeichnet, dass das Detektionsreagenz nicht dazu geeignet ist, die Zellmembran von Blutzellen, die im Vollblut enthalten sind, zu passie ren.

4. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch ge kennzeichnet, dass das Detektionsreagenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Sonde mit Fluorophor, DNA-bindendes Farb stoffmolekül, Reagenz zur Detektion von Pyrophosphat und Kombina tionen hiervon, wobei bevorzugt

i) die Sonde mit Fluorophor ein Oligonukleotid enthält oder daraus besteht, das einen Quencher, ein Fluorophor und eine zwischen Quencher und Fluorophor befindliche DNA-Sequenz enthält oder daraus besteht, wobei die DNA-Sequenz dazu geeignet ist, von ei ner Endonuklease oder Exonuklease gespalten zu werden und be vorzugt eine DHF- oder AP-DNA-Sequenz ist; und/oder ii) das DNA-bindende Farbstoffmolekül ausgewählt ist aus der Grup pe bestehend EVAGreen, SYBR-Green, Syto-Dyes, TOPO-Dyes und Kombinationen hiervon; und/oder

iii) das Reagenz zur Detektion von Pyrophosphat ein Magnesiumsalz ist.

5. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch ge kennzeichnet, dass die Detektion von DNA über eine Detektionseinheit erfolgt, wobei die Detektionseinheit bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Absorptionsmessgerät, Fluoreszenzmessgerät, Turbidimeter, Photoapparat, Mobiltelefon, und Kombinationen hier von.

6. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch ge kennzeichnet, dass eine Quantifizierung der Menge an amplifizierter DNA über eine Auswerteeinheit erfolgt, wobei die Auswerteeinheit bevorzugt kommunikativ mit einer Detektionseinheit verbunden ist.

7. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch ge kennzeichnet, dass mindestens ein Primer des Primerpaars, optional beide Primer des Primerpaars, dazu geeignet ist/sind, an eine repetiti- ve DNA-Sequenz in der DNA des Lebewesens zu binden, bevorzugt an eine repetitive Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ll- NE-Sequenz, SINE-Sequenz und ALU-Sequenz.

8. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch ge kennzeichnet, dass mindestens ein Primer des Primerpaars, optional beide Primer des Primerpaars, dazu geeignet ist/sind, an eine DNA- Sequenz in der DNA des Lebewesens, die zu Beginn, während oder nach einer Krankheit und/oder zu Beginn, während, oder nach einer übermäßigen Muskelbeanspruchung des Lebewesens im Blutkreislauf des Lebewesens vorhanden ist, zu binden.

9. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch ge kennzeichnet, dass während oder nach Schritt d) im Falle von amplifi zierter DNA auf das Vorhandensein einer Krankheit und/oder einer übermäßigen Muskelbeanspruchung geschlossen wird, wobei die Krankheit insbesondere ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Entzündung, Krebs, Autoimmunerkrankung, Herzinfarkt, Schlaganfall, Sepsis, chromosomale Aberration, Veränderung der Kopienzahl bei Genen, Genmutation, und Kombinationen hiervon.

10. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch ge kennzeichnet, dass die Reaktionsmischung mehrere Primerpaare, op tional mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 Primerpaare, enthält, die jeweils zur Amplifikation von mindestens einer im Vollblut befindlichen Nukleinsäure geeignet sind, oder mehrere solcher Primerpaare der Reaktionsmischung zugegeben werden, wobei die jeweiligen

Primerpaare bevorzugt dazu geeignet sind, eine unterschiedliche Nuk leinsäure zu amplifizieren, bevorzugt eine Nukleinsäure, die bei einer übermäßigen Muskelbeanspruchung und/oder einer Krankheit ausge wählt aus der Gruppe bestehend aus Entzündung, Krebs, Autoimmun erkrankung, Herzinfarkt, Schlaganfall, Sepsis, chromosomale Aberrati on, Veränderung der Kopienzahl bei Genen, Genmutation, und Kombi nationen hiervon, im Vollblut eines Lebewesens vorhanden ist.

11. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch ge kennzeichnet, dass die Reaktionsmischung und das Detektionsreagenz, optional die Reaktionsmischung, das Primerpaar und das Detektions reagenz, von einem Lateral-Flow-Strip enthalten sind.

12. Vorrichtung und/oder Kit, geeignet zum //i-v/fro-Nachweis von mindes tens einer Nukleinsäure, die sich bei einem Lebewesen im Vollblut au ßerhalb der Blutzellen befindet, enthaltend

a) eine Reaktionsmischung, die zusammen mit mindestens einem Primerpaar zur Durchführung einer isothermalen Amplifikations reaktion bei einer Temperatur im Bereich von < 45 °C geeignet ist, b) mindestens ein Primerpaar, das zur Amplifikation von mindestens einer im Vollblut befindlichen Nukleinsäure geeignet ist, wobei das mindestens eine Primerpaar optional in der Reaktionsmischung enthalten ist;

c) mindestens ein Detektionsreagenz zur Detektion von DNA, wobei das mindestens eine Detektionsreagenz optional in der Reakti onsmischung enthalten ist;

dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionsmischung dazu geeignet ist, eine Lyse von Blutzellen, die bei einem Lebewesen im Vollblut ent halten sind, zu verhindern.

13. Vorrichtung und/oder Kit gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeich net, dass die Reaktionsmischung

i) dazu geeignet ist, mit Vollblut eine flüssige Mischung zu bilden, die im Wesentlichen isotonisch mit Blutzellen ist; und/oder ii) dazu geeignet ist, mit Vollblut eine flüssige Mischung zu bilden, die eine Osmolarität aufweist, welche im Wesentlichen der Osmolarität von Blutzellen entspricht, bevorzugt eine Osmolarität im Bereich von 230 bis 350 mosmol/kg, bevorzugt 260 bis 320 mosmol/kg, besonders bevorzugt 270 bis 310 mosmol/kg, insbe sondere 280 bis 300 mosmol/kg; und/oder

iii) keine Tenside enthält, die dazu geeignet sind, eine Lyse von Blut zellen zu bewirken, bevorzugt keine Stoffe oder Stoffgemische enthält, die dazu geeignet sind, eine Lyse von Blutzellen zu bewir ken.

14. Vorrichtung und/oder Kit gemäß einem der Ansprüche 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Detektionsreagenz nicht dazu ge eignet ist, die Zellmembran von Blutzellen, die im Vollblut enthalten sind, zu passieren.

15. Vorrichtung und/oder Kit gemäß einem der Ansprüche 12 bis 14, da durch gekennzeichnet, dass das Detektionsreagenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Sonde mit Fluorophor, DNA-bindendes Farbstoffmolekül, Reagenz zur Detektion von Pyrophosphat und Kom binationen hiervon, wobei bevorzugt

i) die Sonde mit Fluorophor ein Oligonukleotid enthält oder daraus besteht, das einen Quencher, ein Fluorophor und eine zwischen Quencher und Fluorophor befindliche DNA-Sequenz enthält oder daraus besteht,, wobei die DNA-Sequenz dazu geeignet ist, von ei ner Endonuklease oder Exonuklease gespalten zu werden und be vorzugt eine DHF- oder AP-DNA-Sequenz ist; und/oder ii) das DNA-bindende Farbstoffmolekül ausgewählt ist aus der Grup pe bestehend EVAGreen, SYBR-Green, Syto-Dyes, TOPO-Dyes und Kombinationen hiervon; und/oder

iii) das Reagenz zur Detektion von Pyrophosphat ein Magnesiumsalz ist.

16. Vorrichtung und/oder Kit gemäß einem der Ansprüche 12 bis 15, da durch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung und/oder der Kit eine De tektionseinheit zur Detektion von DNA enthält/enthalten, wobei die Detektionseinheit bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Absorptionsmessgerät, Fluoreszenzmessgerät, Turbidimeter, Pho toapparat, Mobiltelefon, und Kombinationen hiervon.

17. Vorrichtung und/oder Kit gemäß einem der Ansprüche 12 bis 16, da durch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung und/oder der Kit eine Auswerteeinheit zur Quantifizierung einer Menge an amplifizierter DNA enthält/enthalten, wobei die Auswerteeinheit bevorzugt kommu nikativ mit einer Detektionseinheit verbunden ist.

18. Vorrichtung und/oder Kit gemäß einem der Ansprüche 12 bis 17, da durch gekennzeichnet, dass mindestens ein Primer des Primerpaars, optional beide Primer des Primerpaars, dazu geeignet ist/sind, an eine repetitive DNA-Sequenz in der DNA des Lebewesens zu binden, bevor zugt an eine repetitive Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus LINE-Sequenz, SINE-Sequenz und ALU-Sequenz.

19. Vorrichtung und/oder Kit gemäß einem der Ansprüche 12 bis 18, da durch gekennzeichnet, dass mindestens ein Primer des Primerpaars, optional beide Primer des Primerpaars, dazu geeignet ist/sind, an eine DNA-Sequenz in der DNA des Lebewesens, die zu Beginn, während oder nach einer Krankheit und/oder zu Beginn, während, oder nach ei ner übermäßigen Muskelbeanspruchung des Lebewesens im Blutkreis lauf des Lebewesens vorhanden ist, zu binden.

20. Vorrichtung und/oder Kit gemäß einem der Ansprüche 12 bis 19, da durch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung und/oder der Kit dazu konfiguriert ist, im Falle einer Detektion von DNA durch das Detekti onsreagenz das Vorhandensein einer Krankheit und/oder einer über mäßigen Muskelbeanspruchung anzuzeigen, optional über eine für sichtbares Licht transparente Begrenzung der Vorrichtung, wobei die Krankheit insbesondere ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Entzündung, Krebs, Autoimmunerkrankung, Herzinfarkt, Schlaganfall, Sepsis, chromosomale Aberration, Veränderung der Kopienzahl bei Genen, Genmutation, und Kombinationen hiervon.

21. Vorrichtung und/oder Kit gemäß einem der Ansprüche 12 bis 20, da durch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung und/oder der Kit mehrere Primerpaare, optional mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10

Primerpaare, enthält/enthalten, wobei jedes Primerpaar zur Amplifika tion von mindestens einer im Vollblut befindlichen Nukleinsäure ge eignet ist und wobei die jeweiligen Primerpaare bevorzugt dazu geeig net sind, eine unterschiedliche Nukleinsäure zu amplifizieren, bevor zugt eine Nukleinsäure, die bei einer übermäßigen Muskelbeanspru chung und/oder einer Krankheit ausgewählt aus der Gruppe beste hend aus Entzündung, Krebs, Autoimmunerkrankung, Herzinfarkt, Schlaganfall, Sepsis, chromosomale Aberration, Veränderung der Kopienzahl bei Genen, Genmutation, und Kombinationen hiervon, im Vollblut eines Lebewesens vorhanden ist.

22. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 12 bis 21, dadurch gekenn zeichnet, dass die Vorrichtung ein Lateral-Flow-Strip ist.

23. Kit gemäß einem der Ansprüche 12 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass der Kit einen Lateral-Flow-Strip aufweist, der

i) die Reaktionsmischung enthält; oder

ii) die Reaktionsmischung und das Detektionsreagenz enthält.

24. Verwendung einer Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 12 bis 22, oder einem Kit gemäß einem der Ansprüche 12 bis 21 oder 23, zum di rekten, semiquantitativen oder quantitativen, Nachweis von mindes tens einer Nukleinsäure in Vollblut, bevorzugt zum Nachweis von min destens einer Nukleinsäure, die bei einer Krankheit eines Lebewesens und/oder einer übermäßigen Muskelbeanspruchung des Lebewesens im Vollblut des Lebewesens außerhalb der Blutzellen vorhanden ist.