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1. WO2020002350 - ASSAY, VERFAHREN ZU SEINER HERSTELLUNG SOWIE SEINE VERWENDUNG

Anmerkung: Text basiert auf automatischer optischer Zeichenerkennung (OCR). Verwenden Sie bitte aus rechtlichen Gründen die PDF-Version.

Beschreibung

Assay, Verfahren zu seiner Herstellung sowie seine Verwendung

Die Erfindung betrifft einen insbesondere multiplexen Assay zur Analyse eines Analysats ent-haltend mehrere Targetspezies. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung des Assays sowie seine Verwendung zur Analyse eines Analysats.

Technologischer Hintergrund der Erfindung

Assays sind molekularbiologische Nachweise, die insbesondere in der Labormedizin und Bio-technologie Anwendung finden. Mithilfe von so genannten Fängermolekülen (auch Fängerson-den genannt) werden Targetspezies (auch Biomarker genannt) eines Analysats nachgewiesen, wie zum Beispiel Viren, Proteine oder Nukleinsäuren. Die Nachweise beruhen auf molekülspezi-fischen Affinitätsinteraktionen, wie etwa der Hybridisierung spezifischer Nukleinsäuresequen-zen, Antigen-Antikörper-Wechselwirkung oder Protein-Protein-Interaktionen. Als multiplexe As-says bezeichnet man Assays, bei denen in einem einzigen Durchgang aus einer einzigen Probe gleich mehrere Analyten untersucht und im besten Falle quantifiziert werden können. Die Wei-terentwicklung konventioneller Assays zu multiplexen Assays erhöht den analytischen Durch-satz und erlaubt eine höhere Informationsdichte bei gleichem Input. Damit sind multiplexe As-says unerlässlicher Bestandteil in vielen Bereichen der Molekulardiagnostik und der klinischen Diagnostik. Die Veranlagung für viele Krankheiten wie zum Beispiel Krebs, Alzheimer, Stoff-wechselerkrankungen oder Herz-Kreislauferkrankungen, sowie deren Ausbruch, Ursache und Verlauf hängen häufig von mehreren Faktoren ab. So kann es allein bei Nukleinsäuresequen-zen zu verschiedenen Veränderungen kommen, wie zum Beispiel zum Einzelnukleotid-Polymorphismus (SNP, engl. Single Nukleotide Polymorphism), zur Deletion, Insertion oder Genduplikation, die alle eine Genfunktion beeinflussen können. Weiterhin wird in der Pharma-kogenomik untersucht, wie Medikamente von verschiedenen Organismen unterschiedlich meta-bolisiert werden, was ebenfalls abhängig von multiplen Faktoren ist. Neben Nukleinsäuren kön-nen auch Antikörper bindende Marker genutzt werden, wobei die multiplexe Antikörperdetektion zum Beispiel für die Erforschung und Aufklärung von Autoimmunerkrankungen genutzt werden kann. Deshalb ist die Entwicklung hin zu besseren multiplexen Detektionssystemen für das Ge-sundheitswesen von enormer Bedeutung und auch wirtschaftlich interessant.

Die geläufigsten beiden Arten von multiplexen Assays sind der Microarray und der Microbead-Assay.

Microarray bezeichnet die Anordnung von sehr vielen Microspots auf einer festen Phase, wobei in jedem dieser Spots ein anderes Fängermolekül (Fängersonde) für einen Biomarker immobili-siert ist. Da zu jeder xy-Position bekannt ist, welche Fängersonde sich dort befindet, können aus einer Probe in nur einer Messung sehr viele Biomarker untersucht werden. Das größte Problem der Microarrays ist deren reproduzierbare Abarbeitung und der hohe technische Auf-wand der Herstellung und Auswertung.

Bekannte multiplexe Microbead-Assays hingegen verwenden mikrometergroße Partikel, die so genannten Microbeads, auf deren Oberfläche eine Fängersonde immobilisiert ist, in Suspensi-on. Microbeads weisen eine oder mehrere Kodierungen auf, die es erlauben, unterschiedliche Populationen voneinander zu unterscheiden und der Fängersonde zuzuordnen. In der Praxis beruht die Kodierung in der Regel auf einer Farbkodierung, zum Beispiel die Fluoreszenzwel-lenlänge, und/oder die Partikelgröße. Zur Detektion wird meist ein Durchflusszytometer genutzt. Um die Microbeads auch stationär untersuchen zu können und zusätzlich kinetische Studien durchführen zu können, kann ein Fluoreszenzmikroskop mit entsprechender Software (Vi-deoScan) zur Auswertung und Diskriminierung genutzt werden. Zur Auswertung wird zunächst die Kodierung der Microbeads analysiert, beispielsweise die Farbkodierung über einen ersten Kanal des Durchflusszytometers bzw. von VideoScan und der Durchmesser. Hierdurch können die Microbeads in verschiedene Populationen eingeteilt und der Fängersonde und damit dem an der Fängersonde immobilisierten Biomarker zugeordnet werden. Zur Untersuchung des Pro-bengemischs erfolgt dann mit einem weiteren Kanal die eigentliche Detektion (und Quantifizie-rung) des Biomarkers. Die Menge an Parametern, die in solchen Assays gemessen werden können, spielt dabei eine wichtige Rolle. Diese Menge ist in Microbead-basierten Assays limi-tiert durch die Parameter Größe und Kodierungsfluoreszenz der Microbeads. Ist der Unter-schied des Selektionsparameters zwischen zwei Microbead-Populationen zu gering, kann es zu fehlerhaften Zuordnungen kommen. Ein komplexes Biomolekülgemisch kann die Detektion in einem einfachen Microbead-Assay stören.

Aufgrund ihrer hydrophilen, biokompatiblen und gut modifizierbaren Eigenschaften fanden Hyd-rogelmaterialien in den letzten Jahren ein großes Interesse in zahlreichen biotechnologischen Anwendungen. Insbesondere die lösungsähnlichen Eigenschaften und das Non-Fouling in komplexen biologischen Proben machen Hydrogele zu guten Substraten für die Biosensorik.

Hydrogel-Beschichtungen und Gel-Dot-Oberflächen wurden in Microarrays für Nukleinsäure-Assays und Immunoassays eingesetzt. Durch neue Mikrofabrikationstechniken können kodierte Partikel aus Hydrogelmaterialien synthetisiert werden. Dadurch ist eine Entwicklung von Sus-pensionsarrays auf Hydrogelbasis möglich geworden. Lithographieverfahren und tröpfchenba-sierte mikrofluidische Technologien ermöglichen die Generierung von Hydrogel-Microbeadbibliotheken mit eindeutigen spektralen oder grafischen Codes für die Multiplex-Sensorik (European Polymer Journal, 2015, 72, S. 386-412).

Kurze Beschreibung der Erfindung

Der Erfindung liegt nun die Aufgabe zugrunde, einen auf funktionalisierten Partikeln (Micro-beads) beruhenden Assay bereitzustellen, der die Probleme herkömmlicher Microbead-Assays überwindet. Insbesondere sollte der Assay einfach herzustellen und zu handhaben sein und eine sicherere Diskriminierung der Populationen erlauben.

Diese Aufgaben werden ganz oder zumindest teilweise durch einen Assay, ein Verfahren zu seiner Herstellung sowie seine Verwendung mit den Merkmalen der unabhängigen Ansprüche gelöst. Bevorzugte Ausgestaltungen der Erfindung sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche sowie der vorliegenden Beschreibung.

Der erfindungsgemäße Assay zur Analyse eines Analysats, das mehrere Targetspezies enthält, weist eine Anzahl von k sich in xy-Ebene erstreckenden und in z-Richtung aufeinander ange-ordneten Schichten auf, wobei k eine ganze Zahl von größer/gleich 1 ist. Dabei umfasst jede der k Schichten:

• ein poröses dreidimensionales Polymernetzwerk mit einer vorbestimmten Maschenweite, und

• zumindest eine Population von in dem Polymernetzwerk eingebetteten und immobilisierten Partikeln, jeweils umfassend einen Trägerpartikel und eine an dem Trägerpartikel gebun- dene Fängersonde, die eine Targetspezies des Analysats vorzugsweise spezifisch zu bin- den vermag.

Der erfindungsgemäße Assay zeichnet sich durch verschiedene vorteilhafte Effekte aus. So sind die Partikel durch das dreidimensionale Polymernetzwerk fixiert, wodurch die Handhabung des Assays sehr erleichtert wird und der Assay sogar aufbereitet und wiederholt verwendet werden kann. Das Polymernetzwerk ermöglicht eine Haftung der Partikel auf einer Vielzahl un- terschiedlichster Oberflächen. Zudem erlaubt das Polymernetzwerk die Einstellung einer Ma-schenweite, die zwar der Targetspezies das Eindringen in die Schicht erlaubt, jedoch uner-wünschte größere Bestandteile, beispielsweise Zellfragmente oder dergleichen, ausschließt, wodurch die Sensitivität und Reproduzierbarkeit erhöht wird. Das Polymernetzwerk führt somit zu einem Filtereffekt, der unerwünschte Bestandteile abhält. Ferner wird durch die Immobilisie-rung der Partikel eine ortsspezifische Zuordnung ermöglicht, wodurch die Anzahl der detektier-baren Targetspezies erhöht wird. Dieser Vorteil besteht bereits im Fall von einer einzigen Schicht (k = 1 ), in welcher die Partikel in der xy-Ebene fixiert und somit bei ortsselektiver An-ordnung unterschiedlicher Populationen innerhalb der Schichtebene mehrere Targetspezies nachweisbar sind. Durch die Polymereinbettung der Partikel können diese ortsspezifisch und mit höherer Genauigkeit detektiert werden und die Spezifität und Sensitivität bei Messung eines Targetspezies in einem komplexen Analysats verbessert werden.

Die Anzahl nachweisbarer Targetspezies wird erhöht, wenn die Anzahl k der Polymernetz-werk/Partikel-Schichten 2 oder mehr ist. In diesem Fall wird als ein weiterer Ortsparameter, der eine Zuordnung einer Partikelpopulation erlaubt, die z-Position erschlossen. Das heißt, inner-halb des kartesischen Koordinatensystems kann eine dreidimensionale Diskriminierung von Partikelpopulationen anhand der Koordinaten x, y, z erfolgen. Gegenüber einer einzigen Poly-mernetzwerk/Partikel-Schicht (k = 1) erhöht sich somit die theoretisch maximal mögliche Anzahl diskriminierbarer Partikelpopulation und somit nachweisbarer Targetspezies um einen Faktor k.

Die maximale Anzahl der Polymernetzwerk/Partikel-Schichten ist allenfalls durch das zur Aus-wertung verwendete Detektionssystem begrenzt, das hier insbesondere ein Fluoreszenzmikro-skop, beispielsweise ein Epifluoreszenzmikroskop oder konfokales Fluoreszenzmikroskop ist.

So wird die Gesamthöhe des Assays limitiert durch den zur Verfügung stehenden Raum des Mikroskops. In einer Ausgestaltung beträgt die Anzahl der Schichten 2 bis 10, insbesondere 2 bis 6.

Die Populationen der Partikel unterscheiden sich insbesondere in den Fängersonden, die an den Trägerpartikeln gekoppelt sind. Somit dient jede Population als ein spezifischer Detektor für eine Targetspezies. Da in jeder Schicht k mehrere Populationen immobilisiert werden können, erhöht sich der Multiplexgrad um ein /c-faches.

Die Maschenweite der in den Schichten vorhandenen Polymernetzwerke sollte so klein sein, dass die Partikel fixiert sind, sich also nicht bewegen können. Die Maschenweite sollte anderer-seits mindestens so groß sein, dass sich die Targetspezies der in dieser Schicht enthaltenen Partikelpopulation weitestgehend frei innerhalb der Poren bewegen kann, um in die Schicht einzudringen und an die Fängersonde koppeln zu können.

In einer bevorzugten Ausgestaltung nimmt die Maschenweite der Polymernetzwerke der k Schichten in z-Richtung in Richtung der Schwerkraft, also nach unten ab. Insbesondere in die sem Zusammenhang ist bevorzugt vorgesehen, dass diejenige Partikelpopulation, welche die kleinste Targetspezies bindet, innerhalb der untersten Schicht angeordnet ist. Die zweitunterste Schicht enthält dann die Partikelpopulation, welche die zweitkleinste Targetspezies bindet, und so weiter. Mit anderen Worten werden die Partikelpopulationen in der Reihenfolge der Größe ihrer Targetspezies und zwar mit zunehmender Größe ihrer Targetspezies in z-Richtung von unten nach oben angeordnet. In diesen Ausgestaltungen werden die Filtereffekte der Hydrogel-schichten gezielt genutzt, um im idealen Fall stets nur diejenigen Targetspezies durchzulassen, deren komplementären Fängersonden in einer der folgenden Schichten angeordnet sind. Hier-durch kann die Spezifität des Nachweises noch weiter verbessert werden.

In bevorzugter Ausgestaltung der Erfindung ist vorgesehen, dass eine mittlere Maschenweite des Polymernetzwerks im Bereich von 1 nm bis 1000 nm, insbesondere 1 nm bis 200 nm, vor-zugsweise 2 nm bis 50 nm, liegt. Wie vorstehend bereits ausgeführt, ist in diesem Bereich die Maschenweite klein genug, um die Partikel zu immobilisieren und optional bestimmte Molekül-oder Teilchengrößen auszuschließen, und gleichzeitig groß genug, um die erwünschten Target-spezies durchzulassen.

Im Rahmen der vorliegenden Anmeldung bezeichnet der Begriff„dreidimensionales Polymer-netzwerk“ ein polymeres Material, das über kovalente oder nicht kovalente (vorzugsweise kova-lente Bindungen) quervernetzt ist und somit in einem Lösungsmittel quellbar oder gequollen vorliegt, sodass sich Poren ausbilden, die mit dem Lösungsmittel gefüllt sind. Vorzugsweise handelt es sich bei dem dreidimensionalen Polymernetzwerk um ein Hydrogel, das also in Was-ser quellbar bzw. gequollen vorliegt. Hydrogele eignen sich insbesondere für biologische oder biomedizinische Anwendungen.

In einer vorteilhaften Ausführung umfasst der Assay - zusätzlich zu den k Polymernetz-werk/Partikel-Schichten - eine weitere, bezüglich der Schwerkraft oberste Schicht, die ein porö-ses Polymernetzwerk mit einer vorbestimmten Porengröße, jedoch keine Partikel aufweist. Ins-besondere weist das Polymernetzwerk dieser„Leerschicht“ die größte Maschenweite aller vor-handenen Schichten auf. Dabei ist die Maschenweite dieser obersten Leerschicht so bemes-sen, dass große Bestandteile des Analysats, die nicht zu den zu detektierenden Targetspezies gehören, ausgeschlossen werden. Der obersten Schicht dieser Ausführung kommt somit aus-schließlich eine Filterfunktion zu.

Vorzugsweise sind die Partikel einer Schicht einlagig innerhalb der xy-Ebene angeordnet. Auf diese Weise wird die Trennschärfe zwischen aneinander angrenzenden Schichten erhöht.

Wie bereits erwähnt, unterscheiden sich die Partikel unterschiedlicher Populationen in ihren Fängersonden, sodass jede Population eine bestimmte Targetspezies zu binden vermag. Dar-über hinaus bietet die erfindungsgemäße Immobilisierung der Partikel in dem dreidimensionalen Polymernetzwerk den Vorteil, dass zusätzlich zur Kodierung etwa durch Fluoreszenz und Größe eine räumliche Kodierung durch die z-Position (sofern mehr als eine Polymernetzwerk/Partikel-Schicht vorhanden ist) eingeführt wird. Auf diese Weise kann durch entsprechende Fokussie-rung eines bei der Auswertung verwendeten Instruments (beispielsweise eines Mikroskops) eine Identifizierung einer jeweiligen Population allein aufgrund der Position erfolgen.

In bevorzugter Ausgestaltung der Erfindung sind die Partikelpopulationen mit Vorteil durch eine oder mehrere weitere Kodierungseigenschaften voneinander unterscheidbar, um die Diskrimi-nierung und Identifizierung verschiedener Populationen noch weiter zu verbessern. In diesem Zusammenhang kann die Kodierungseigenschaft eine Partikelgröße, insbesondere ein Partikel-durchmesser und/oder eine Partikeldurchmesserverteilung; eine Partikelform; eine optische Eigenschaft, insbesondere eine Farbe oder Fluoreszenzwellenlänge; eine magnetische Eigen-schaft; ein Partikelmaterial; ein Partikelbeschichtungsmaterial; eine Oberflächenstruktur oder eine Kombination mehrerer dieser Parameter sein. Die Kodierungseigenschaft ist vorzugsweise eine Eigenschaft der Trägerpartikel. Derartige Partikel sind etwa aus herkömmlichen Microbe-ad-Assays bekannt.

Besonders bevorzugt sind die Partikelpopulationen durch eine Kodierungseigenschaft identifi-zierbar (d.h. einer Fängersonde zuordenbar) und weisen zusätzlich eine Indikatoreigenschaft auf, die eine Unterscheidung darüber ermöglicht, ob die entsprechende Targetspezies gebun-den hat oder nicht. Zu diesem Zweck ist insbesondere eine optische Eigenschaft der Partikel geeignet, etwa eine Intensität oder Wellenlänge einer Absorptions- oder Emissionsstrahlung der Partikel, welche sich bei Bindung der Targetspezies ändert. Bekannt ist etwa, die Trägerpartikel mit einer Fluoreszenzmarkierung (Fluoreszenzfarbstoff) auszustatten, wobei die Targetspezies einen Quencher tragen, sodass bei Bindung die Fluoreszenz abnimmt. Alternativ kann die Tar-getspezies eine eigene optische Eigenschaft aufweisen (zum Beispiel Fluoreszenz) oder mit einer Fluoreszenzmarkierung (vor oder nach der Bindung an die Fängersonde) ausgestattet

werden, sodass bei Bindung die Fluoreszenz zunimmt. In allen vorgenannten Fällen ist nicht nur die Messung der qualitativen Bindung der Targetspezies möglich, sondern auch die Erfas-sung der Quantität, nämlich aufgrund der Intensität. Derartige Ansätze sind aus herkömmlichen Assays bekannt.

Die Schichtstruktur der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise in einem Gefäß bzw. auf einem Träger angeordnet. In besonders bevorzugter Ausführung weist der Träger ein Array einer Viel-zahl von Kavitäten oder Spots auf, wobei in den Kavitäten bzw. auf den Spots jeweils ein Assay gemäß der Erfindung mit jeweils einer Anzahl von / sich in xy-Ebene erstreckenden und in z-Richtung aufeinander angeordneten Schichten wie vorstehend beschrieben angeordnet sind.

Ein solcher Träger kann etwa als Mikrotiterplatte ausgeführt sein, deren Wells als Kavitäten dienen. Dabei unterscheiden sich vorzugsweise die Populationen von Partikeln der verschiede-nen Kavitäten zumindest durch die an den Trägerpartikeln gebundenen Fängersonden. In die sem Ausführungsbeispiel legen die Kavitäten die xy-Position der verschiedenen Populationen fest und erlauben somit ihre Identifizierung.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Assays, das einen schichtweisen Aufbau vorsieht. Das Verfahren umfasst die folgenden Schrit te:

• Aufbringen zumindest einer Population Partikel auf ein Substrat und

• Aufbringen einer vernetzbaren Zusammensetzung auf die Partikel, Vernetzen der Zusam- mensetzung unter Erhalt des dreidimensionalen Polymernetzwerks, in welches die Partikel eingebettet sind.

Diese Schritte werden /c-fach wiederholt, entsprechend der Anzahl k der herzustellenden Poly-mernetzwerk/Partikel-Schichten.

In alternativer Ausführung wird eine Mischung der zumindest einen Partikelpopulation und der vernetzbaren Zusammensetzung auf das Substrat aufgegeben und vernetzt unter Erhalt des dreidimensionalen Polymernetzwerks, in welches die Partikel eingebettet sind.

Die Zusammensetzung weist vorzugsweise einen bi-funktionalen Polymerlinker einer vorbe-stimmten Kettenlänge und einen höher-funktionalen Vernetzer auf. Auf diese Weise definiert die Kettenlänge des bi-funktionalen Polymerlinkers die Maschenweite (Porengröße) des entstehen-den Polymernetzwerks. Insbesondere wird hier die Kettenlänge des bi-funktionalen Polymerlin-kers einer (/c+1 )-ten Wiederholung so gewählt, dass diese länger ist als die Kettelänge in der k-ten Wiederholung. Anders gesagt, nimmt die Kettenlänge (bzw. das Molekluargewicht) des Lin-

kers mit jeder weiteren Schicht zu. Auf diese Weise lässt sich ein Assay mit schichtweise zu-nehmender Maschenweite herstellten. Zur Herstellung eines Polymernetzwerks in Form eines Hydrogels aus einem vernetzten Polyethylenglykol kann beispielsweise ein bi-funktionalisiertes Polyethylenglykol definierter Kettenlänge (definierten Molekluargewichts) mit einem dendriti-schen Polyglycerol vernetzt werden.

Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung des erfindungs-gemäßen Assays zur Analyse eines Analysats enthaltend mehrere Targetspezies. Die Verwen-dung umfasst die Schritte:

• Aufbringen des Analysats auf die in Richtung der Schwerkraft obersten Schicht des Assays;

• Inkubieren für eine vorbestimmte Zeit; und

• ortsaufgelöstes Detektieren der Partikel und Detektieren der an den Partikeln gebundenen Targetspezies.

Die verschiedenen in dieser Anmeldung genannten Ausführungsformen der Erfindung sind, sofern im Einzelfall nicht anders ausgeführt, mit Vorteil miteinander kombinierbar.

Die Erfindung wird nachfolgend in Ausführungsbeispielen anhand der zugehörigen Zeichnun-gen erläutert. Es zeigen:

Figur 1 eine schematisierte Darstellung eines multiplexen Assays mit drei Polymer- netzwerk/Partikel-Schichten gemäß einer Ausführungsform der Erfindung;

Figur 2 einen erfindungsgemäßen multiplexen Assay in einer Mikrotiterplatte in Drauf- sicht (A) sowie als Seitenansicht (B);

Figur 3 Fluoreszenzaufnahmen eines erfindungsgemäßen Assays (A) sowie von Par- tikeln in Suspension (B), jeweils 1 h nach Einfüllen der Präparationslösung in eine Kavität (1 ), nach Trocknung über Nacht bei Raumtemperatur (2), nach Resuspension durch Zugabe von Wasser (3) und nach mehrmaligem Wa- schen, Ausleeren und Ausklopfen (4);

Figur 4 eine schematisierte Darstellung eines Assays mit einer Polymernetz- werk/Partikel-Schicht zum Nachweis eines Fab-Fragments in Gegenwart ei- nes Antikörpers gemäß einer Ausführungsform der Erfindung;

Figur 5 Fluoreszenzintensitäten des Assays aus Figur 4 nach verschiedenen Inkuba- tionszeiten;

Figur 6 eine schematisierte Darstellung eines Assays mit zwei Polymernetz- werk/Partikel-Schichten zum Nachweis eines Fab-Fragments und eines 20mer-Oligonukleotids in Gegenwart eines Antikörpers gemäß einer Ausfüh- rungsform der Erfindung;

Figur 7 Fluoreszenzintensitäten der ersten Detektionsebene (links) und zweiten De- tektionsebene (rechts) des Assays aus Figur 6 in Abhängigkeit von der Inku- bationszeit;

Figur 8 eine schematisierte Darstellung reversibler Übergänge eines erfindungsge- mäßen Assays zwischen einem voll gequollenen Zustand (a), einem teilweise gequollenen Zustand (b) und einem trockenen Zustand (c); und

Figur 9 Quellung verschiedener PEG-Hydrogele gemäß Figur 8 über mehrere Trock- nungs- und Quellzyklen.

Figur 1 zeigt in einer stark schematisierten Darstellung einen multiplexen Assay gemäß einer beispielhaften Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung. Die Darstellung zeigt den insgesamt mit 1 bezeichneten Assay in der xz-Ebene, wobei die yz-Ebene im dargestellten Beispiel iden-tisch wäre. Der Assay 1 umfasst eine Anzahl von k (hier k = 3) Schichten 10, die jeweils ein dreidimensionales Polymernetzwerk 1 1 sowie zumindest eine Population von in dem Polymer-netzwerk 11 eingebetteten und immobilisierten Partikeln 12 umfasst. Eine solche Polymernetz-werk/Partikel-Schicht wird nachfolgend auch als Detektionsschicht 10 bezeichnet. Im gezeigten Beispiel ist auf der obersten der drei Detektionsschichten 10 eine optionale weitere Schicht 20 angeordnet, die als„Leerschicht“ ausgebildet ist und als solche eine weitere Schicht eines drei-dimensionalen Polymernetzwerks 1 1 , jedoch keine Partikel aufweist. Die Polymernetzwerke weisen im dargestellten Ausführungsbeispiel eine Maschenweite bzw. Porengröße auf, die von unten nach oben, also in z-Richtung entgegen der Schwerkraft zunimmt.

Im gezeigten Beispiel umfasst jede der Detektionsschichten 10 jeweils eine Population von Par-tikeln 12, die rechts vergrößert dargestellt sind. Jedes Partikel 12 einer Population weist ein Trägerpartikel 13 und eine an dem Trägerpartikel 13 gebundene Fängersonde 14 auf, die eine Targetspezies eines Analysats spezifisch zu binden vermag. Somit dient jede Population der Detektion einer anderen Targetspezies. In dem gezeigten Beispiel unterscheiden sich die Popu-lationen neben der Fängersonde 14 auch durch eine Kodierungseigenschaft, die eine Identifi zierung der Population durch ein geeignetes Detektionsverfahren erlaubt. Die Kodierungseigen-schaft ist hier durch unterschiedliche Schraffuren der Trägerpartikel 13 angedeutet.

Der Assay 1 umfasst ferner ein Gefäß oder einen T räger 30, in bzw. auf welchem die

Schichtstruktur aus Detektionsschichten 10 und gegebenenfalls der„Leerschicht“ 20 angeord-net ist.

Figur 2 zeigt ein erfindungsgemäßes Assay-Produkt 100. Das Assay-Produkt 100 umfasst einen Träger 30, auf dem ein Array einer Vielzahl von Assays 1 gemäß der Erfindung angeordnet ist. Im dargestellten Beispiel ist der Träger 30 als eine so genannte Mikrotiterplatte 31 mit standar-disierten Abmessungen ausgebildet. Die Mikrotiterplatte 31 weist ein Array aus beispielsweise 12 x 8 Kavitäten 32 auf, die auch als Wells bezeichnet werden. In jeder Kavität 32 ist ein erfin dungsgemäßer Assay 1 umfassend eine Schichtstruktur aus Detektionsschicht(en) 10 und ge-gebenenfalls der„Leerschicht“ 20 angeordnet, wie etwa in Figur 1 gezeigt. Dabei können die in den einzelnen Kavitäten 32 angeordneten Partikel 12 unterschiedlichen Populationen angehö-ren und somit für unterschiedliche Targetspezies sensitiv sein.

Abweichend von Figur 2 kann der Träger 30 auch die Gestalt einer planen Scheibe aufweisen, auf der ein Array aus Spots mit jeweils einem Assay 1 aufgebracht ist.

Nachfolgend sollen die Komponenten des erfindungsgemäßen Assays näher erläutert werden.

Polvmernetzwerk

Mit Polymernetzwerk 11 wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein in einer flüssigen Pha-se gequollenes oder quellfähiges, dreidimensional vernetztes Polymer verstanden. Vorzugswei-se ist das Polymernetzwerk in Wasser oder einer wässrigen Phase gequollen oder quellfähig, also ein Hydrogel. Dies ermöglicht den Einsatz für biomedizinische Analysen. Für andere An-wendungen sind jedoch auch Polymernetzwerke geeignet, die in organischen Lösungsmitteln gequollen oder quellfähig sind.

Aufgabe des Polymernetzwerks ist einerseits die Fixierung der Partikel. Andererseits muss das gequollene Polymernetzwerk eine Porosität aufweisen, die eine lösungsähnliche Umgebung für die Diffusion der Targetspezies bietet, damit diese die Partikel erreichen.

Das Polymernetzwerk 1 1 bildet hierzu Poren oder Maschen aus, deren Größe durch die Ketten-längen des Polymers zwischen den Vernetzungspunkten definiert werden. Dabei ist die Ma-schenweite so klein, dass die Partikel 12 ortsfest fixiert sind, sich also nicht verlagern können. Die Maschenweite ist andererseits mindestens so groß, dass sich die Targetspezies der in die-ser Schicht 10 enthaltenen Partikelpopulation weitestgehend frei innerhalb der Poren bewegen kann, um in die Schicht eindringen und an die Fängersonde 13 koppeln zu können. Die mittlere Maschenweite des Polymernetzwerks liegt insbesondere im Bereich von 1 nm bis 1000 nm, insbesondere von 1 nm bis 200 nm, vorzugsweise 2 nm bis 50 nm.

Die Maschenweite der Polymernetzwerke 11 der k Detektionsschichten 10 sowie der optionalen Schicht 20 kann in z-Richtung in Richtung der Schwerkraft, also von oben nach unten abneh-men. Auf diese Weise entsteht ein abgestufter Filtereffekt, wobei entlang des Weges eines auf den Assay aufgegebenen Analysats nur Bestandteile mit abnehmenden Größen durchgelassen werden und Bestandteile, deren hydrodynamischer Durchmesser die Maschengröße übersteigt, an den jeweiligen Grenzflächen zwischen zwei Schichten 10, 20 abgehalten werden. Beispiels-weise kann das Polymernetzwerk der untersten Schicht eine geringe Maschenweite aufweisen, die von Oligonukleotiden durchdrungen werden kann, nicht jedoch von größeren Biomolekülen wie zum Beispiel Proteinen oder Antikörpern. Dabei kann das Polymernetzwerk einer mittleren Schicht nur mittelgroße Moleküle, zum Beispiel ein Fab-Fragment oder Protein, durchlassen und größere Antikörper ausschließen. Durch die geeignete Auswahl der Porengrößen können die zu analysierenden Moleküle (Targetspezies) in die jeweiligen Schichten selektiv dirigiert werden. Da grundsätzlich ein geeigneter Filtereffekt bereits durch das Polymernetzwerk 1 1 der zuoberst angeordnete Detektionsschicht 10 erzielt werden kann, kann auf die„Leerschicht“ 20 auch verzichtet werden.

In Ausgestaltungen der Erfindung weist das Polymernetzwerk 11 ionische (kationische oder anionische) Gruppen auf. Hierdurch kann ebenfalls ein Filtereffekt erzielt werden, indem gleich-geladene Bestandteile des Analysats abgestoßen und somit zurückgehalten werden und entge-gengesetzt geladene Bestandteile durchgelassen werden. Diese Art der Polyarisierung kann auch in Kombination zu der vorstehend dargestellten abgestuften Maschenweite realisiert wer-den.

Das Polymernetzwerk 1 1 kann aus einem Polymerlinker hergestellt sein, der mittels eines Ver-netzers vernetzt ist. Dabei kann die Maschenweite durch geeignete Wahl der Kettenlänge (bzw. des Molekulargewichts) des Polymerlinkers und/oder des Vernetzers eingestellt werden. Die

Vernetzung lässt sich auf einfache Weise erzeugen, indem der Polymerlinker an seinen beiden Kettenenden mit jeweils einer reaktiven Gruppe funktionalisiert ist und der Vernetzer drei oder mehr funktionelle Gruppen aufweist, die mit den funktionellen Gruppen unter Ausbildung einer chemischen Bindung zu reagieren vermögen. Dabei kann in Abhängigkeit von der Art der funk-tionellen Gruppen die Kupplungsreaktion spontan durch Mischen der beiden Komponenten er-folgen oder durch Zugabe eines Initiators oder durch Bestrahlung mit einer geeigneten Strah-lung ausgelöst werden.

Aus stofflicher Hinsicht ist das Polymernetzwerk 11 vorzugsweise so zu wählen, dass es sich neutral gegenüber dem Analysat und den Partikeln verhält, also mit keiner der Komponenten reagiert oder anderweitig wechselwirkt. Diese Eigenschaft wird auch als bioorthogonal bezeich-net. Gleichzeitig ermöglicht eine geeignete Wahl des Polymernetzwerks in Abhängigkeit von dem Material des Trägers 30, auf welches die Partikel immobilisiert werden sollen, eine gute Haftung, so dass ein sehr stabiler Verbund zwischen Substrat und Polymernetzwerk erhalten wird und somit auch die Partikel mit hoher Stabilität fixiert werden.

Geeignete Polymersysteme umfassen insbesondere Polyether, Polyalkohole, Polyacrylate, Po-lyacylamide (u.a. Poly(N-isopropylacrylamid PNIPAM), Polyimide (u.a. Polyetherimid PEI), Aga-rose, Zellulosen, modifizierte Zellulosen (u.a. Chitosan), Polysaccharide, Dextrane, Polyvi-nylpyrrolidone, etc.

In einer vorteilhaften Ausgestaltung ist das Polymernetzwerk 11 ein Hydrogel, das ein durch ein dendritisches Polyglycerol (dPG) vernetztes Polyethylenglykol (PEG) umfasst. Ein geeignetes Paar funktioneller Gruppen, die spontan (ohne Initiator, ohne thermische Anregung und ohne Photoanregung) miteinander reagieren, ist insbesondere Cyclooktin und Azid. Weitere Paare funktioneller Gruppen sind etwa Thiol und Acrylat, die zum Beispiel über eine Thiol-En-Reaktion miteinander reagieren, Keton/Hydroxylamin, oder Gruppen, die im Wege einer Diels-Alder-Reaktion oder einer Staudinger-Ligation miteinander reagieren. Prinzipiell sind andere Kupp-lungsreaktionen möglich sowie andere Gelkomponenten. Bevorzugt ist, dass die Vernetzungs-reaktion schnell genug verläuft, um lange Reaktionszeiten zu vermeiden. Sofern die Herstellung der Schicht aus einer Mischung aus Vernetzungszusammensetzung und Partikeln erfolgt, sollte die Reaktionzeit der Vernetzung andererseits langsam genug ablaufen, so dass die Partikel während der Gelierung auf die darunter liegende Schicht absinken können. Auf diese Weise wird eine Anordnung der Partikel in einer definierten Ebene gewährleistet, die durch ein Aus-wertungsinstrument, beispielsweise in einer Fokusebene eines Fluoreszenzmikroskops, scharf erfasst werden kann. Die Reaktionszeit kann u.a. durch die Variation der Konzentration, durch die Temperatur und/oder gegebenenfalls der Konzentration eines Initiators beeinflusst werden. Es sollten bevorzugt keine Nebenprodukte entstehen und die Reaktion möglichst bei Raum-temperatur stattfinden, um die Präparation schnell, einfach und ökonomisch zu gestalten. Die Reaktion zur Gelbildung sollte bioorthogonal sein um zu verhindern, dass diffundierende Biomo-leküle mit dem Netzwerk interagieren und unspezifisch im Gel hängen bleiben und somit die Detektion erschweren oder verfälschen.

Die Art des Polymernetzwerks 1 1 kann für alle Schichten 10, 20 identisch oder unterschiedlich sein. Bevorzugt wird das gleiche Polymersystem für sämtliche Schichten 10, 20 gegebenenfalls mit variierenden Maschenweiten eingesetzt.

Partikel

Die Detektionspartikel 12 haben einerseits die Funktion, eine Targetspezies möglichst spezi-fisch zu binden, und andererseits, eine Identifizierung der Targetspezies anhand der Positions-daten des Partikels innerhalb des Assays und/oder einer anderen Kodierungseigenschaft des Partikels zu ermöglichen.

Zum Zweck der spezifischen Bindung weisen die Partikel 12 Fängersonden 14 auf, die an Trä-gerpartikel 13 gebunden sind. Mit Fängersonde wird vorliegend ein Molekül oder eine chemi-sche Gruppe bezeichnet, das/die eine möglichst spezifische Wechselwirkung mit der jeweiligen Targetspezies einzugehen vermag, um diese zu binden. Die Fängersonde sollte somit eine ho-he Affinität zur Targetspezies aufweisen und wird dementsprechend abhängig von dieser ge-wählt. Handelt es sich bei der Targetspezies etwa um eine Nukleinsäure, so kann die Fänger-sonde eine komplementäre Nukleinsäuresequenz sein, die mit der Targetsequenz hybridisiert. Ist die Targetspezies ein Antikörper, so kann die Fängersonde ein komplementäres Antigen sein, das mit dem Antikörper über Protein/Protein-Wechselwirkungen interagiert, oder umge-kehrt. Darüber hinaus ist jede Art chemischer Kopplungsreaktion zwischen Fängersonde 14 und Targetspezies über eine geeignete Wahl der Fängersonde 14 realisierbar.

Die Fängersonde 14 ist an das Trägerpartikel 13 gebunden. Das Trägerpartikel 13 kann aus einem beliebigen Material bestehen und verhält sich vorzugsweise inert in dem jeweiligen Sys-tem. Infrage kommende Materialien umfassen Gläser, Metalle, Kunststoffe oder Mischungen oder Komposite aus diesen Werkstoffen. In beispielhaften Ausführungen bestehen die Träger-partikel 13 aus einem Kunststoff, beispielsweise Polymethylmethacrylat (PMMA). Die Träger-partikel 13 können eine beliebige Form aufweisen. Vorzugsweise haben sie eine sphärische

Gestalt. Die Größe bzw. der Durchmesser der Trägerpartikel 13 ist nicht limitiert und kann im Bereich von 100 nm bis 1000 pm, insbesondere im Bereich von 1000 nm bis 100 pm, bevorzugt im Bereich von 8 pm bis 20 pm gewählt werden.

Aufgrund ihrer Fixierung im Hydrogel 11 können die Partikel 12 bereits durch ihre Position iden-tifizierbar sein. So ist die Identifizierung insbesondere in z-Richtung durch Zuordnung zu einer bestimmten Detektionsschicht 10 gegeben. Darüber hinaus kann auch eine Identifizierung über die xy-Koordinaten möglich sein, insbesondere bei Anordnung in einer Mikrotiterplatte (S. Figur 2) oder durch anderweitige ortsspezifische Anordnung der Partikel.

Optional können die Partikel 12 zudem eine Kodierungseigenschaft aufweisen, die eine Zuord-nung der Partikel zu einer bestimmten Population und somit einer bestimmten Fängersonde 14 ermöglicht oder erleichtert. Geeignete Kodierungseigenschaften umfassen die Partikelgröße, insbesondere Partikeldurchmesser und/oder Partikeldurchmesserverteilung; die Partikelform; eine optische Eigenschaft, wie Farbe oder Fluoreszenzwellenlänge; eine magnetische Eigen-schaft; das Partikelmaterial; ein Partikelbeschichtungsmaterial; die Oberflächenstruktur oder eine Kombination mehrerer dieser Parameter. Die Kodierungseigenschaft ist vorzugsweise eine Eigenschaft des Trägerpartikels 13.

Besonders bevorzugt weisen die Partikel 12 zusätzlich eine Indikatoreigenschaft auf, die eine Unterscheidung darüber ermöglicht, ob die entsprechende Targetspezies an eine Population gebunden hat oder nicht. Idealerweise lässt die Indikatoreigenschaft auch eine Quantifizierung der gebundenen Targetspezies zu. Zu diesem Zweck ist insbesondere eine optische Eigen-schaft der Partikel geeignet, etwa eine Intensität oder Wellenlänge einer Absorptions- oder Emissionsstrahlung der Partikel, welche sich bei Bindung der Targetspezies ändert. Bekannt ist etwa, die Trägerpartikel 13 mit einer Fluoreszenzmarkierung (Fluoreszenzfarbstoff) auszustat-ten, wobei die Targetspezies einen Quencher tragen, sodass bei Bindung die Fluoreszenz ab-nimmt. Alternativ kann die Targetspezies eine eigene optische Eigenschaft aufweisen (zum Bei-spiel Fluoreszenz) oder mit einer Fluoreszenzmarkierung (vor oder nach der Bindung an die Fängersonde) ausgestattet werden, sodass bei Bindung die Fluoreszenz zunimmt. In allen vor-genannten Fällen ist nicht nur die Messung der qualitativen Bindung des Targetspezies mög-lich, sondern auch die Erfassung der Quantität, nämlich aufgrund der Intensität. Derartige An-sätze sind aus herkömmlichen Assays bekannt.

Grundsätzlich sind im Rahmen der Erfindung als Partikel 12 Microbeads einsetzbar, wie sie aus herkömmlichen Microbead-Assays bekannt sind.

Aufbau des Assavs

Der erfindungsgemäße Assay 1 umfasst k Detektionsschichten, enthaltend das Hydrogel 1 1 und eine oder mehrere Populationen an Partikeln 12. Je höher die Anzahl k der Schichten, des-to mehr Partikelpopulationen können in dem Assay angeordnet und desto mehr Targetspezies können detektiert werden. Die Anzahl k der Schichten 10, in denen die Detektion vorgenommen wird, kann auf die Assayanforderungen zugeschnitten werden. Sie ist limitiert durch den Aufbau des Analyseinstruments, das in z-Richtung an seine Grenzen stoßen kann.

Eine Dicke der Schichten 10 sollte mindestens so bemessen sein, dass die Partikel 12, insbe-sondere in einlagiger Anordnung, vollständig eingebettet sind. Vorzugsweise ist die Schichtdi-cke um ein vorbestimmtes Maß größer als die (einlagige) Partikelschicht. Geeignete Schichtdi-cken der Schichten 10, 20 liegen etwa im Bereich von 100 pm bis 5 mm. Die Gesamtdicke des Schichtaufbaus des Assays 1 ist somit die Summe aller individueller Schichtdicken sämtlicher Detektionsschichten 10 und gegebenenfalls der Leerschicht 20, wobei die Schichtdicken gleich oder unterschiedlich sein können.

Die Partikel 12 einer Schicht 10 sind vorzugsweise in einer Ebene, insbesondere einlagig ange-ordnet, um eine möglich scharfe Fokussierung und leichte Diskriminierung von einer benachbar-ten Schicht 10 zu ermöglichen. Insbesondere können die Partikel 12, wie in Figur 1 gezeigt, nahe der Grenzfläche zur darunterliegenden Schicht angeordnet sein bzw. zum Träger 30.

Herstellung des Assavs

Die Herstellung des erfindungsgemäßen Assays 1 erfolgt schichtweise von unten nach oben.

Gemäß einem bevorzugten Herstellungsverfahren wird zumindest eine erste Population von Partikeln 12 auf das Substrat 30, insbesondere auf den Boden einer Kavität 32 einer Mikrotiter-platte 31 aufgebracht, beispielsweise aufgestreut. Hierbei kommt es zu einer gleichmäßigen Verteilung der ersten Partikelpopulation auf dem Substrat. Anschließend wird eine vernetzbare Zusammensetzung auf die Partikel 12 gegeben und die Vernetzung (Gelierung) gegebenenfalls initialisiert oder einfach abgewartet, wobei die erste (unterste) Schicht 10 eines Polymernetz-werks 1 1 erhalten wird, das die erste Partikelpopulation einbettet und am Boden fixiert. Nach ausreichender Vernetzung (Gelbildung) wird auf die erste Schicht eine zweite Population von Partikeln aufgegeben und auf diese eine weitere vernetzbare Zusammensetzung, die nach dem Vernetzen die zweite Polymerschicht 10 ausbildet, welche die zweite Partikelpopulation einbet-tet und auf der ersten Schicht fixiert. Diese Schritte werden so oft mit weiteren Partikelpopulati-onen wiederholt, bis die gewünschte Anzahl k von Detektionsschichten 10 aufgebaut ist. Optio-nal kann zum Abschluss die„Leerschicht“ 20 erzeugt werden, indem lediglich eine vernetzbare Zusammensetzung auf die oberste Detektionsschicht 10 aufgegeben und vernetzt wird.

In einem alternativen Ansatz erfolgt die Aufgabe der Partikel 12 und der vernetzbaren Zusam-mensetzung nicht sequentiell, sondern es wird für jede Detektionsschicht 10 eine Mischung aus Partikeln 12 und vernetzbarer Zusammensetzung auf den Träger 30 bzw. die darunterliegende Schicht 10 gegeben und die Zusammensetzung unter Ausbildung des Hydrogels vernetzt. In diesem Fall ist es wünschenswert, dass die Vernetzungsreaktion langsam genug abläuft, um den Partikeln ein Absinken auf das Substrat 30 bzw. die darunterliegende Schicht 10 zu erlau-ben.

Die vernetzbare Zusammensetzung enthält Komponenten, die nach ihrer Vernetzungsreaktion das polymere Netzwerk ausbilden, sowie ein geeignetes Lösungsmittel für diese Komponenten, insbesondere Wasser oder eine wässrige Phase, und gegebenenfalls Initiatoren. Die vernetzba-ren Komponenten können prinzipiell polymerisationsfähige Monomere und Vernetzer umfassen, so dass die Vernetzungsreaktion gleichzeitig mit der Polymerisation erfolgt. Vorzugsweise er-folgt die Herstellung jedoch aus bereits vorpolymerisierten Komponenten (Polymerlinker), die mit einem Vernetzer vernetzt werden (s. Ausführungen zum Polymernetzwerk oben). Auf diese Weise lassen sich die zu erzeugenden Maschenweiten der einzelnen Schichten leichter kontrol-lieren.

Anwendung des Assavs

Die Anwendung des Assays zur Analyse eines Analysats, das mehrere Targetspezies enthält, erfolgt, indem das Analysat auf die oberste Schicht (oberste Detektionsschicht 10 bzw. Leer-schicht 20) des Assays 1 aufgegeben wird, beispielsweise aufpipettiert wird. Da die Partikel 12 im Polymernetzwerk/Hydrogel 1 1 fixiert sind, sind auch mechanische Belastungen wie Wa-schen, Schütteln oder Durchpipettieren unproblematisch.

Anschließend lässt man das System für eine vorbestimmte Zeit inkubieren, um eine Diffusion der Targetspezies in die jeweiligen Zielschichten 10 zu ermöglichen. Durch die lösungsähnliche Umgebung des Polymernetzwerks ist die Diffusion zwar verlangsamt, die Targetspezies können

sich jedoch in denjenigen Schichten frei bewegen, in denen die Gelporen es zulassen. Die vor-bestimmte Zeit hängt insbesondere von der Anzahl k der Schichten 10 und von den Größen der Targetspezies ab. Es haben sich Inkubationszeiten im Bereich von wenigen Minuten bis einigen Tagen, insbesondere 2 h bis 24 h bewährt.

Anschließend erfolgt die Auswertung, die eine ortsaufgelöste Detektion der Partikel 12 und ein Bestimmen der an den Partikeln 12 gebundenen Targetspezies umfasst. Die Detektion der Par-tikel 12 bzw. das hierfür eingesetzte Instrument bestimmt sich nach Art der Partikel 12 insbe-sondere nach ihrer Kodierung. Sind die Partikel fluoreszenzmarkiert, erfolgt die Detektion etwa mit einem Fluoreszenzmikroskop. Die ortsaufgelöste Detektion umfasst insbesondere die z-Koordinate, wofür der Fokus des Mikroskops auf die jeweilige Schicht 10 eingestellt wird, so dass die detektierte Fluoreszenzwellenlänge maximal wird. Dies erfolgt vorzugsweise mittels Autofokus des Instruments. Darüber hinaus kann auch eine xy-Kodierung erfolgen, insbesonde-re indem unterschiedliche Assays 1 in den Kavitäten 32 einer Mikrotiterplatte 31 angeordnet sind. Hierzu erfolgt eine Verstellung eines xy-Tisches, auf dem der Assay angeordnet ist, oder durch Verstellung der Optik des Instruments in xy-Ebene. Da für jede Koordinate im dreidimen-sionalen Raum bekannt ist, welche Partikelpopulation dort angeordnet ist, d.h. welche Target-spezies hier theoretisch vorhanden sein kann, muss nun nur noch bestimmt werden, ob eine Targetspezies und optional wieviel von dieser angebunden hat. Im einfachsten Fall kann die Targetspezies selbst eine messbare Eigenschaft aufweisen, beispielsweise selbst fluoreszieren oder einen Fluoreszenzmarker tragen. In diesem Fall wird die entsprechende Intensität der Flu-oreszenz gemessen und ausgewertet. Je mehr Moleküle der entsprechenden Targetspezies an einem Ort (beispielsweise in einer z-Ebene) gebunden haben, desto höher wird die an diesem Ort gemessene Fluoreszenz. Alternativ können die Partikel 12 mit einem Fluoreszenzmarker ausgestattet sein, so dass die Targetspezies als Fluoreszenzquencher wirkt. In diesem Fall wird die an einem Ort gemessene Fluoreszenzintensität umso niedriger, je mehr Targetspezies ge-bunden hat. Die Auswertung erfolgt mit Hilfe einer Software, die zum einen die Fluoreszenzko-dierung der Microbeads 12 erkennt und zuordnen kann. Zum anderen wird in einem weiteren Kanal die Hülle der Microbeads analysiert, wobei hier die Intensität der Fluoreszenz von der Menge des gebundenen Targetmoleküls abhängig ist. Man erhält also für jede Ebene und zu jeder gewählten Microbeadpopulation eine Fluoreszenzintensität, die mit der Menge an Target korreliert. Um die jeweiligen Ebenen auslesen zu können, wird ein Bereich in z-Richtung vorge-geben, in dem die Software automatisch die Microbeads einer Ebene fokussiert und die Aus-wertung vollzogen werden kann. Dieser z-Bereich für den Autofokus legt den Mindestabstand fest, der zwischen den Ebenen k, und ki+1 liegen muss. Er ist abhängig von der Rauigkeit der Oberfläche einer Hydrogelschicht und damit von der Höhenverteilung der einzelnen Microbeads 12 innerhalb der Ebene. Je planer die Microbeads ausliegen, desto schärfer kann die Software fokussieren und desto mehr Ebenen können in der Gesamtschichtdicke D untergebracht wer-den. Somit wird die Geschwindigkeit der Analyse erhöht.

Die Methoden zur Detektion sind im Wesentlichen aus den eingangs beschriebenen Verfahren bekannt und können analog angewendet werden. Gegenüber den bekannten Microbead-Assays, bei denen die Partikel als Suspension in einer flüssigen Phase vorliegen und ausge-wertet werden, weist der erfindungsgemäße Assay den Vorteil auf, dass die Partikel bereits durch ihre dreidimensionale Position identifizierbar sind. Hierdurch kann gegebenenfalls auf eine Kodierung verzichtet oder die Anzahl der Kodierungseigenschaften pro Population redu-ziert werden.

Anwendunqsbeispiele

In allen nachfolgend beschriebenen Beispielen wurden als Partikel 12 sphärische fluoreszenz-kodierte Microbeads aus PMMA (Fa. PolyAn GmbH, Deutschland) mit mittleren Partikeldurch-messern von 12 pm und 18 pm verwendet.

Die Hydrogele wurden jeweils durch Vernetzen von mit Cyclooctin homobifunktionalisierten Po-lyethylenglykol-Linkern mit unterschiedlichen Molekulargewichten (PEG-Linker, z.B. PEG 3 kDa, PEG 6 kDa oder PEG 10 kDa) mit einem mit Azid-Gruppen mehrfach funktionalisiertem dendri-tischen Polyglycerol (dPG, z.B. MW = 1-10 kDa) hergestellt. Die Vernetzungsreaktion wurde jeweils bei Raumtemperatur in wässriger Phase durchgeführt.

Beispiel 1 - Versuche zur Stabilität des Assays

Die Microbeads sollen, wie vorstehend beschrieben, nicht die Maschen des Hydrogels penetrie-ren können und durch die Überschichtung mit dem Hydrogel dauerhaft am Wellboden immobili-siert werden. Um das zu zeigen, wurde ein Assay gemäß der Erfindung in Kavitäten (Wells) eines Kavitätsstreifens (Nunc™ NucleoLink™) hergestellt, umfassend eine Schicht Microbeads, die in einem Hydrogel aus einem PEG-Netzwerk eingebettet wurden ( k = 1 ).

Diese Assays gemäß der Erfindung wurden verschiedenen Bedingungen ausgesetzt und die Anordnung der Microbeads in den nachfolgenden Zuständen (1 ) bis (4) am Wellboden mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskop verfolgt (siehe Bilderserie in Fig. 3A). Als Vergleich wurde die glei- che Population an Microbeads, jedoch in Suspension anstelle des Hydrogels, den gleichen Be-handlungen ausgesetzt (siehe Bilderserie in Fig. 3B).

(1 ) Präparationslösung, 1 h nach Einfüllen in das Well.

(2) Eintrocknen lassen, über Nacht bei Raumtemperatur.

(3) Resuspension durch Zugabe von Wasser und mehrmaliges Auf- und Abpipettieren.

(4) Nach dem Waschen, umfassend Ausleeren, Ausklopfen und einmaliges (Fig. 3B) bzw. mehrmaliges Waschen (Fig. 3A) mit PBS Puffer.

Die Bilderserie in Figur 3B zeigt, dass die Microbeads in Puffer zunächst gleichmäßig im Well verteilt sind (B1 ), durch Eintrocknen (B2) bilden sich Aggregate in der Mitte des Wells. Durch Resuspension (B3) werden die Microbeads erneut gleichmäßig verteilt, jedoch in geänderter Anordnung. Wird der Well entleert und einmal mit Pufferlösung gewaschen (B4), bleiben keine Microbeads im Well zurück. Hingegen zeigen die erfindungsgemäß mit Hydrogel überschichte-ten Microbeads, dass sich die Anordnung der Microbeads am Wellboden zu keinem Zeitpunkt ändert. Auch nach mehrmaligem Waschen und Ausklopfen bleiben die Microbeads durch das Hydrogel am Boden fixiert (Figur 3A).

Beispiel 2 - Filtereffekt des Assays

Das Vermögen des erfindungsgemäßen Assays, große Moleküle auszuschließen, während kleinere diffundieren können, wurde beispielhaft an einem Analysat enthaltend einen fluores-zenzmarkierten Antikörper sowie ein vergleichsweise kleines, ebenfalls fluoreszenzmarkiertes Fab-Fragment (Fragment antigen binding), also einem Antikörper-Fragment, untersucht. Hierzu wurde ein Assay 1 hergestellt, indem eine Microbeadpopulation 12 an einem Wellboden einer Mikrotiterplatte aufgebracht und mit dem Hydrogel 11 (PEG 6 kDa) überschichtet und immobili-siert wurde (s. Figur 4). Als Fängersonde trugen die Microbeads 12 einen Antikörper, der in Lö-sung mit beiden Komponenten des Analysats, dem Fab-Fragment 15 und dem Antikörper 16, eine Affinitätsinteraktion zeigt. Nach Hinzugabe des Analysats auf den Assay 1 wurde über ei-nen Zeitraum von 7 Tagen inkubiert. Zu Beginn und nach 24 h, 48 h und 7 Tagen wurden in der Fokusebene der Microbeads 12 die Intensitäten jeweils der Fluoreszenzwellenlänge des Fab-Fragments 15 und des Antikörpers 16 ausgelesen. Das Ergebnis ist in Figur 5 gezeigt. Es ist ersichtlich, dass selbst nach 7 Tagen der größere Antikörper 16 nur ein schwach detektierbares Signal zeigt, während das kleinere Fab-Fragment bereits nach 24 h deutlich an den Microbeads 12 nachweisbar ist. Figur 4 zeigt, dass die kleineren Fab-Moleküle 15 die Netzwerkporen des Hydrogels 11 zu durchwandern vermögen, während die größeren Antikörper 16 kaum in das Netzwerk eindringen.

Beispiel 3 - Multiplexer Assay

Als konzeptionellen Beweis für die Fähigkeit zur multiplexen Detektion wurde ein erfindungs-gemäßer Assay 1 mit zwei Detektionsschichten 10i und 102 hergestellt (k = 2, Figur 6). Dazu wurde eine erste Population an Microbeads 12-i, versehen mit einem fluoreszenzmarkierten Oligonukleotid (Fängersonde für ein komplementäres Oligonukleotid 20mer 17), in der ersten Schicht 10i mit einem erfindungsgemäßen Hydrogel (PEG 6 kDa) überschichtet und immobili-siert. Microbeads 122, die einen Antikörper trugen, wurden in der zweiten Schicht 102 durch ein Hydrogel (PEG 10 kDa) mit größerer Maschenweite überschichtet und immobilisiert. Durch das Hydrogel waren beide Populationen der Microbeads 12-i und 122 auch räumlich voneinander getrennt. Der gleiche Assay 1 , wie in Figur 6 dargestellt, wurde in sieben Wells eines 8-Well Streifens (Nunc™ NucleoLink™) hergestellt. In dem achten Well wurden zu Vergleichszwecken die beiden Mikrobead-Populationen12-i und 122 in Suspension gegeben. In die so präparierten Wells wurden je 15 mί Lösung der im Folgenden aufgeführten Targetspezies (allein oder in Mi-schungen) gegeben und mit PBS Puffer zu einem Gesamtvolumen von 45 mί aufgefüllt.

(Oligo = 20mer Detektionsoligonukleotid mit Quenchermolekül markiert (17); Fab = Fab-Fragment mit einem Fluoreszenzfarbstoffmolekül markiert (15), Ab = Antikörper mit einem Fluo-reszenzfarbstoffmolekül markiert (16), Fluorescent Oligo = willkürliche Oligonukleotidsequenz mit einem Fluoreszenzfarbstoffmolekül markiert)

Die entsprechenden Fluoreszenzintensitäten beider Schichten 10-i und 102 in Well Nr. 1 bis 7 sowie die Fluoreszenzintensitäten der Suspension in Well Nr. 8 wurden über einen Zeitraum von 48 Stunden mit einer Software (VideoScan) ausgelesen (s. Figur 7). In allen Wells, in de-nen das Detektionsoligonukleotid 17 zugegeben wurde, wurde in der ersten Ebene 10i die am Microbead 12-i bestehende Fluoreszenz gequencht. Auch in den Wells, in denen nicht nur das Detektionsoligonukleotid 17 alleinig sondern auch in Mischung mit den anderen fluoreszenz-markierten Molekülen 15, 16 zugegeben wurde (Well 4, 5 und 6), wurde die am Microbead be-stehende Fluoreszenz gequencht (siehe Fig. 7 links, ungefüllte Symbole). Das zeigt, dass eine eindeutige Detektion möglich ist und die Hintergrundfluoreszenz der zugegebenen Lösung zu keinem Artefakt in der Detektion führt. In den Wells jedoch, in denen das Detektionsoligonukleo-tid 17 nicht zugegeben wurde, bleibt die Fluoreszenz erhalten (siehe Fig. 7 links, gefüllte Sym-bole). Ebenso wurde in allen Wells, in denen das Fab-Fragment 15 zugefügt wurde, ein linearer Anstieg der Fluoreszenz die am Microbead 122 in der zweiten Ebene 102 erhalten (siehe Fig. 7 rechts, ungefüllte Symbole). Der deutlich flachere Anstieg im Vergleich zu den Microbeads in Suspension (siehe Fig. 7 rechts, x-Marker, Ab_solution), ist mit der verlangsamten Diffusion durch die Maschen des Hydrogels zu erklären. In allen Fällen jedoch, in denen der Antikörper (Ab) 16 zugegeben wurde, wurde bis zum Ende der Messzeit kein Anstieg der Fluoreszenz be-obachtet. Zudem ist an dem Erhalt der Fluoreszenz in der ersten Schicht 10i nach Zugabe des unspezifischen Oligonukleotids (siehe Fig. 7 links, fluorescent Oligo, gefüllte Kreise) zu erken-nen, dass das willkürliche Oligonukleotid nicht unspezifisch an dem Oligonukleotid der Fänger-sonde bindet.

Wie in Figur 6 schematisch dargestellt, konnten also sehr kleine flexible Moleküle wie das 20mere Oligonukleotid 17 den gesamten Assay 1 durchdringen. Das kleine bis mittelgroße Fab-Fragment 15 hat dagegen nur die oberste Schicht 102 durchdrungen, die untere Schicht 10-i jedoch nicht erreicht. Große Moleküle, wie hier am Beispiel des Antikörpers 16 gezeigt, können somit effektiv ausgeschlossen werden. Es ergibt sich eine räumlich getrennte, größenselektive Detektion.

Beispiel 4 - Reversibilität der Quellung

In diesem Versuch wurden zwei Ebenen Microbeads mittels einer Hydrogelschicht immobilisiert sowie räumlich voneinander getrennt (siehe Figur 8). Dabei wurden Hydrogele unterschiedlicher Maschenweiten eingesetzt (PEG 3 kDa, PEG 6 kDa, PEG 10 kDa). Diese Systeme wurden über eine Gesamtzeit von bis zu 4 Wochen mehreren Trocknungs-/Quell-Zyklen unterworfen, wobei jeder Zyklus den Übergang des Hydrogels aus einem vollständig gequollenen Zustand (Fig. 8a) in einen vollständig getrockneten, kollabierten Zustand (Fig. 8c) und erneute Quellung durch Zugabe von Wasser umfasste. Wie in Figur 9 dargestellt, ließ sich das kleinmaschige Hydrogel PEG 3 kDa über 5 Zyklen ausreichend reversibel trocknen und erneut quellen. Für die beiden größerporigen Hydrogele PEG 6 kDa und PEG 10 kDa konnte dies sogar für 7 Zyklen gezeigt werden. Es ist also möglich, die durch das Hydrogel separierten Ebenen reversibel eintrocknen und wieder aufschwellen zu lassen, ohne dass das Gel reißt und die Microbeads durch die Ma-schen in tiefere Ebenen fallen.

Um den erfindungsgemäßen Assay leicht und wirtschaftlich handhabbar zu gestalten, ist es von Vorteil, dass für die Anwendung möglichst wenige Komponenten und Fachwissen benötigt wer-den. Dieser Versuch belegt, dass der erfindungsgemäße Assay als getrocknetes Produkt ver-

trieben und gelagert werden kann und der Anwender durch einfaches Hinzugeben einer wässri-gen Lösung oder Wasser ein gebrauchsfertiges Produkt erhält. Im nassen, geschwollenen Zu-stand sind die Gele in der Lage, die Ebenen auszubilden und ihre Poren für die Diffusion der Targetspezies zu öffnen. Der getrocknete Zustand des Assays ist für die Lagerung und den T ransport vom Hersteller zum Anwender von Vorteil, da der Assay so noch weniger anfällig für äußere Einflüsse ist (Temperatur, mechanische Defekte wie Risse, Kreuz-Kontamination etc.).

Bezugszeichenliste

Assay

Schicht / Detektionsschicht

dreidimensionales Polymernetzwerk / Hydrogel Partikel / Microbead

Trägerpartikel

Fängersonde

Targetspezies

Antikörper

Targetspezies

oberste Schicht / Leerschicht

T räger / Gefäß / Substrat

Mikrotiterplatte

Kavität / Well

Assay-Produkt