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1. (WO2019030422) USE OF LEVOTHYROXINE FOR THE TREATMENT OF DIABETES MELLITUS
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USO DE LEVOTIROXINA PARA EL TRATAMIENTO DE LA DIABETES MELLITUS

DESCRIPCIÓN

La presente invención se encuentra dentro del campo de la Medicina y la Farmacia, y se refiere al uso de tiromiméticos, y preferiblemente al uso de derivados y análogos de la levotiroxina, en el tratamiento de la diabetes mellitus, particularmente diabetes mellitus tipo 1.

ESTADO DEL ARTE

El control glucémico está exquisitamente orquestado por las hormonas secretadas por los islotes de Langerhans, las cuales ejercen efectos sobre múltiples tejidos diana. En la patogénesis de la Diabetes Mellitus Tipo 2 (T2DM), los tejidos diana de la insulina desarrollan gradualmente resistencia a la insulina. Como resultado de esta resistencia, existe un aumento de la demanda de producción de insulina para mantener la concentración de glucosa en la circulación dentro del rango fisiológico. Bajo estas circunstancias las células β pancreáticas sobreproducen insulina, lo que en las últimas etapas de la enfermedad resulta en la sobrecarga y finalmente apoptosis de las células β. A diferencia de la DM2, en la Diabetes Mellitus tipo 1 (T1 DM), existe un ataque directo y específico de las células inmunes que destruye selectivamente las células β pancreáticas. Tanto en la T1 DM como en la T2DM, la falta de una masa funcional de células β produce hiperglucemia, propulsando un ciclo vicioso de trastornos metabólicos.

El uso de las hormonas tiroideas (TH) y de los tiromiméticos recién generados prometen mejorar la homeostasis metabólica debido a su potente efecto sobre la pérdida de peso y la reducción de los niveles de colesterol (Lin y Sun, 201 1 , Lange et al., 201 1). La triyodotironina (T3) y la levotiroxina (T4), producidas en la glándula tiroides, son las TH principales. La T4 se convierte en T3 dentro de las células por la acción de las deiodinasas. Curiosamente, la T4 es menos activa pero más estable (190 horas) que la T3. La actividad media de la T3 es aproximadamente 3-5 veces mayor que T4, pero la estabilidad es de 19 horas en pacientes eutiroideos. Existen también otras TH o tiromiméticos tales como triac, tetrac, tirinaminas, T3 inversa, 3,5-diyodo-l-tiroina y glucagón conjugado/T3 que están adquiriendo atención últimamente en la comunidad científica como fármacos prometedores para el tratamiento de varias patologías (Ball et al., 1997, Goglia, 2014, Shang et al., 2013, Senese et al., 2014, Finan et al., 2016). Una de las principales funciones fisiológicas de las THs es la regulación de la tasa metabólica basal, definida aquí como la tasa de gasto de energía por tiempo de reposo, que representa alrededor del 60-75% de las calorías

quemadas en un sujeto sano. Específicamente, las THs aumentan el consumo de oxígeno y las tasas de hidrólisis de ATP, mientras reducen el estado acoplado de las mitocondrias y la capacidad máxima para producir ATP (Johannsen et al., 2012). En realidad, las THs son conocidas por inducir el catabolismo de todo tipo de fuentes de energía (Weinstein et al., 1991). Producen la reducción de triglicéridos circulantes y lipoproteínas que contienen colesterol, así como la inducción de la gluconeogénesis hepática y glucogenólisis (Bahn et al., 201 1). El incremento en gluconeogénesis y glucogenólisis puede proporcionar la cantidad de combustible necesaria para mantener los requerimientos energéticos de los diferentes tejidos (Dimitriadis y Raptis, 2001 , Klieverik et al., 2008).

Los mecanismos de acción de las TH en las células, implican la modulación de la expresión génica en un proceso mediado por la unión a sus receptores TH (THR). Los complejos TH-THR unidos a las secuencias de ADN específicas modulan la expresión de más de 80 genes (Shoemaker et al. , 2012, Dong et al., 2009). En este contexto, múltiples procesos celulares esenciales son orquestados por las TH, como la biogénesis mitocondrial en el sistema nervioso y el aparato contráctil del retículo endoplásmico en el corazón (Iwen et al., 2013, Vargas-Uricoechea et al., 2014). Además, también se han descrito efectos no genómicos de las TH (por ejemplo, la activación de la señalización AKT a través del THR-β) (Verga Falzacappa et al., 2009, Vicinanza et al., 2013).

Todos estos mecanismos ponen de manifiesto el potencial uso de las THs y los tiromiméticos en el tratamiento de la T2DM. Sin embargo, no se ha demostrado el efecto de las TH ni los tiromiméticos en el tratamiento de la Diabetes Mellitus Tipo 1 (T1 DM).

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Fig. 1. El tratamiento con T4 incrementa el aclaramiento de la glucosa en los ratones silvestres C57BL/6. (A) Concentración de glucosa en la circulación durante dos horas post carga de glucosa (OGTT). Edad= 10 semanas, n = 13 por grupo. (B) Area debajo de la curva (AUC) de los niveles de glucosa durante el OGTT. (C) Niveles de insulina en plasma durante dos horas post carga de glucosa (OGTT). Edad = 9 semanas, n = 7 no tratados; n = 8 tratados con T4. (D) AUC de los niveles de insulin durante el OGTT. (E) Concentración de glucosa en la circulación después de recibir una inyección intraperitoneal de piruvato (IPPTT). Edad = 8 semanas, n = 7 no tratados; n = 8 tratados con T4. (F) AUC de los niveles de glucosa durante el IPPTT. (G) Concentración de glucosa en la circulación después de recibir una inyección intraperitoneal de insulina (ITT). Edad = 1 1 semanas, n = 12 no tratados; n = 13 tratados con T4. (H) AUC de los niveles de glucosa durante el ITT. (I) Concentración de glucosa en la circulación durante un periodo de 24 horas en ayunas. Edad = 12 semanas, n = 7 no tratados; n = 8 tratados con T4. (J) AUC de los niveles de glucosa durante un periodo de 24 horas en ayunas. (K) Niveles de insulina en plasma después de 16 horas de ayuno. Edad = 12 semanas, n = 7 no tratados; n = 8 tratados con T4. (L) Porcentaje de hemoglobina glicosilada (HbA1 c) en la circulación. Edad = 23 semanas, n = 9 no tratados; n = 14 tratados con T4. UT: No tratados; T4: Tratados con T4. Los datos están representados como la media ± SEM (error estándar de la media). * p < 0.05 en comparación con los ratones no tratados {prueba t de student de dos colas).

Fig. 2. El tratamiento con T4 reduce el peso corporal y mejora el rendimiento de los ratones durante el rotarod. (A) Peso corporal. Edad = 24 semanas, n = 12 no tratados; n = 18 tratados con T4. (B) Tiempo en caer del rotarod en aceleración. Edad = 21 semanas, n = 12 no tratados; n = 18 tratados con T4. (C) Consumo de energía. Edad = 8 semanas, n = 7 no tratados; n = 8 tratados con T4. (D) Peso de los diferentes órganos. Edad = 24 semanas. Para el hígado, corazón, tejido adiposo blanco, tejido adiposo marrón, cerebro, bazo y los ríñones n = 12 no tratados; n = 18 tratados con T4. Para el tiroides y la pituitaria n = 6 no tratados; n = 7 tratados con T4. (E) Peso de los diferentes órganos dividido por el peso corporal. Edad = 24 semanas. Para el hígado, corazón, tejido adiposo blanco, tejido adiposo marrón, cerebro, bazo y los ríñones n = 12 no tratados; n = 18 tratados con T4. Para el tiroides y la pituitaria n = 6 no tratados; n = 7 tratados con T4. Los datos están representados como la media ± SEM (error estándar de la media). * p < 0.05 en comparación con los ratones no tratados {prueba t de student de dos colas).

Fig. 3. El tratamiento con T4 aumenta la expresión de insulin y promueve la proliferación de las células β. (A) Imágenes representativas de las tinciones de insulina (INS), glucagón (GLC) y glucoquinasa (GK) en los páncreas de ratones no tratados o tratados con T4. Tinción de DAB seguida de una contratinción con hematoxilina. Barra de escala = 50 μηι. INS; n = 5 por grupo. GLC; n = 5 por grupo. GK; n = 6 por grupo. (B) Cuantificacion de la tinción de insulina (intensidad media). (C) Cuantificacion de la tinción de glucagón (intensidad media). (D) Determinación del contenido de insulina de los islotes pancreáticos por ELISA, n = 6 no tratados, n = 7 tratados con T4. (E) Cuantificacion de la tinción con glucoquinasa (intensidad media). (F) Determinación de GSIS. n = 6 no tratados, n = 7 tratados con T4. (G) Imágenes representativas de las tinciones de Ki67 e insulina en los páncreas de animales no tratados o tratados con T4. Inmunofluorescencia seguida de tinción con Dapi. Barra de escala, 50 μηι. n = 5 por grupo. (H) Porcentaje de células Ki67+- lnsulina+ sobre el total de células insulina+. (I) Porcentaje de células Ki67+-lnsulina" sobre el total de células insulina" dentro de los islotes pancreáticos. (J) Imágenes representativas de la tinción con túnel e insulina en los páncreas de ratones no tratados o tratados con T4. Inmunofluorescencia seguida de tinción con Dapi. Barra de escala = 50 μηι. n = 5 por grupo. (K) Porcentaje de células tunel+-lnsulina+ sobre el total de células insulina+. (L) Porcentaje de células tunel+-lnsulin" sobre el total de células insulina" residentes en los islotes pancreáticos. UT: No tratados; T4: Tratados con T4. Las flechas indican una tinción representativa positiva. Los datos están representados como la media ± SEM (error estándar de la media). * p < 0.05 en comparación con los ratones no tratados (prueba t de student de dos colas).

Fig. 4. El tratamiento con T4 activa la señalización de la insulina en el músculo esquelético y el hígado. (A) Determinación de los niveles de RNA mensajero (mRNA) de distintas proteínas involucradas en la vía de la insulina en el músculo esquelético de ratones tratados o no con T4. Los ratones se mantuvieron en ayunas durante 16 horas antes de la eutanasia. Los valores fueron normalizados a los ratones no tratados. IR-β; n = 5. IRS1 ; n = 6. AKT; n = 5. FOX01 ; n = 6. GSKS-β; n = 6. ERK; n= 6. (B) Determinación de los niveles de RNA mensajero (mRNA) de distintas proteínas involucradas en la vía de la insulina en el hígado de ratones tratados o no con T4. Los ratones se mantuvieron en ayunas durante 16 horas antes de la eutanasia. Los valores fueron normalizados a los ratones no tratados. IR-β; n = 6 no tratados, n = 5 tratados con T4. IRS1 ; n = 6 no tratados, n = 5 tratados con T4. AKT; n = 6. FOX01 ; n = 6 no tratados, n = 5 tratados con T4. GSKS-β; n = 5. ERK; n = 6 no tratados, n = 5 tratados con T4. (C) Western blots indicando la activación de la señalización de la insulina en el músculo esquelético y el hígado de los ratones tratados con T4. Los ratones se mantuvieron en ayunas durante 16 horas antes de la eutanasia, n = 5 per group. (D) Análisis desintométrico de los western blots realizados en los extractos de músculo esquelético presentados en el panel C. Los valores fueron normalizados a los ratones no tratados. (E) Análisis desintométrico de los western blots realizados en los extractos de hígado presentados en el panel C. Los valores fueron normalizados a los ratones no tratados. (F) Imágenes representativas de los western blots que muestran la máxima activación de la señalización de la insulin en los ratones tratados y no tratados con T4, después de recibir una inyección de insulina (0.75U.kg"1 de peso corporal) en los 15 minutos previos a la eutanasia. Los ratones se mantuvieron en ayunas durante 16 horas antes de la eutanasia. (G) Análisis desintomético de los western blots realizados en los extractos de músculo esquelético enseñados en la Figura de Apoyo S4A. n = 5 no tratado, n = 6 tratados con T4. Los valores fueron normalizados a los ratones no tratados. (H) Análisis

desintomético de los western blots realizados en los extractos de hígado mostrados en la Figura de Apoyo S4A. n = 5 no tratados, n = 6 tratados con T4. Los datos están representados como la media ± SEM (error estándar de la media). * p < 0.05 en comparación con los ratones no tratados {prueba t de student de dos colas).

Fig. 5. El tratamiento con T4 bloquea el inicio de la ET1 DM en el modelo animal RIP-B7.1 de ET1 DM e incrementa la supervivencia en ratones C57BL/6 tratados con estreptpzotocina. (A) Peso Corporal de los ratones RIP-B7.1. n = 8 no tratados; n = 9 tratados con T4. (B) Peso de los órganos de los ratones RIP-B7.1. n = 6 no tratados; n = 9 tratados con T4. (C) Concentración de glucosa en la circulación durante un OGTT realizado a los ratones RIP-B7.1 a las 4 semanas de tratamiento con T4. n = 8 no tratado; n = 9 tratado con T4. (D) AUC de los niveles de glucosa durante el OGTT. (E) Concentración de glucosa en la circulación durante un ITT realizado a los ratones RIP-B7.1 a las 5 semanas del tratamiento con T4. n = 7 no tratados; n = 9 tratados con T4. (F) AUC de los niveles de glucosa durante el ITT. (G) Concentración de glucosa postpandrial en la circulación en los ratones RIP-B7.1. n = 8 no tratados; n = 9 tratados con T4. (H) Niveles de insulina en la circulación en condiciones postpandriales. n = 7 no tratados; n = 8 tratados con T4. (I) Supervivencia de los ratones C57BL/6 tratados con estreptozotocina. n = 9 por grupo. (J) Concentración de glucosa postpandrial en la circulación en ratones C57BL/6 tratados con estreptozotocina. Fueron incluidos todos los animales vivos en el tiempo correspondiente (ver Figura 51 para la n en cada punto de tiempo). UT: no tratados; T4: tratados con T4; IMM: Inmunización. Las flechas indicant el tiempo de la inmunización. Los datos están representados como la media ± SEM (error estándar de la media). * p < 0.05 en comparación con los ratones no tratados (prueba t de student de dos colas). Para las curvas de supervivencia se realizó un test LogRank.

Fig. 6. La T4 aumenta la expression de insulin y potencia la proliferación de las células β en el modelo RIP-B7.1 de diabetes autoinmune experimenta. (A) Imágenes representativas de las tinciones de glucagón (GLC) e insulina (INS) en los páncreas de ratones RIP-B7.1 inmunizados tratados o no con T4. Tinción de DAB seguida de una contratinción con hematoxilina. Barra de escala, 50 μηι. n = 6 no tratados; n = 5 tratados con T4. (B) Cuantificacion de la tinción de insulina (densidad media). (C) Cuantificacion de la tinción de glucagón (intensidad media). (D) Imágenes representativas de las tinciones de Ki67 e insulina en los páncreas de ratones RIP-B7.1 inmunizados tratados o no con T4. Inmunofluorescencia seguida de una tinción con Dapi. Barra de escala = 50 μηι. n = 5 no

tratados; n = 5 tratados con T4. (E) Porcentaje de células Ki67+-lnsulina+ sobre el total de células insulina+. (F) Imágenes representativas de la tinción con túnel e insulina de los páncreas de los ratones RIP-B7.1 inmunizados tratados o no con T4. Inmunofluorescencia seguida de una tinción con Dapi. Barra de escala = 50 μηι. n = 5 por grupo. (G) Porcentaje de células túnel lnsulina+ sobre el total de células insulina+. UT: no tratados; T4: tratados con T4. Las flechas indican una tinción representativa positiva. Los datos están representados como la media ± SEM (error estándar de la media). * p < 0.05 en comparación con los ratones no tratados {prueba t de student de dos colas).

Información de Apoyo Fig. S1. Niveles de glucosa en los tests metabólicos expresados como el porcentaje de la glucosa basal. (A) Niveles de T4 en la circulación en condiciones postpandriales. Edad = 13 semanas, n = 7 no tratados; n = 8 tratados con T4. (B) Concentración de glucosa en la circulación durante el OGTT expresada como el porcentaje de la glucosa basal (tiempo 0). n = 13 por grupo. (C) Concentración de glucosa en la circulación durante el IPTT expresada como el porcentaje de la glucosa basal. n = 7 no tratados; n = 8 tratados con T4. (D) Concentración de glucosa en la circulación durante el ITT expresada como el porcentaje de la glucosa basal. n = 12 no tratados; n = 13 tratados con T4. (E) Concentración de glucosa en la circulación durante un periodo de 24 horas en ayuno expresada como el porcentaje de la glucosa basal. n = 7 no tratados; n = 8 tratados con T4. (F) Modelo de evaluación de homeostasis de la resistencia a la insulina (HOMA-IR). Edad = 12 semanas, n = 7 no tratados; n = 8 tratados con T4. UT: no tratados; T4: tratados con T4. Los datos están representados como la media ± SEM (error estándar de la media) en comparación con los ratones no tratados. La prueba t de student de dos colas se aplicó en los paneles A y F. La prueba Mann-Whitney Rank Sum se aplicó en los paneles B-E.

Información de apoyo Fig. S2. Consumo de energía e histología del tiroides y la pituitaria de los ratones tratados o no con T4. (A) Consumo de energía dividido por el peso corporal, n = 7 no tratados; n = 8 tratados con T4. (B) Imágenes representativas de los análisis histológicos del tiroides y la pituitaria de los ratones tratados o no con T4. Tiroides; n = 6 no tratados; n = 7 tratados con T4. Pituitaria; n = 5 no tratados; n = 6 tratados con T4. (C) Determinación de la α-GSU de las hormonas pituitarias en el suero de animales tratados o no con T4. n = 7 no tratados; n = 8 tratados con T4. UT: No tratados; T4: tratados con T4. Los datos están representados como la media ± SEM (error estándar de la media). * p < 0.05 en comparación con los ratones no tratados (prueba t de student de dos colas).

Información de Apoyo Fig. S3. La localización subcelular de MAFA y FOX01 no está afectada por la suplementacion con T4. (A) Islotes pancreáticos de animales tratados o no con T4. Determinación de los niveles de RNA mensajero de genes involucrados en el metabolismo de los islotes pancreáticos. Los valores fueron normalizados a los islotes de los ratones no tratados, n = 6 no tratados; n = 5 tratados con T4. (B) Imágenes representativas de las tinciones por inmunofluorescencia de MAFA e insulina (INS) en los páncreas de ratones tratados o no con T4. Barra de escala = 50 μηι. n = 5 por grupo. (C) Imágenes representativas de las tinciones por inmunofluorescencia de FOX01 e insulina (INS) en los páncreas de ratones tratados o no con T4. Barra de escala = 50 μηι. n = 5 por grupo. UT: No tratados; T4: tratados con T4. Los datos están representados como la media ± SEM (error estándar de la media). * p < 0.05 en comparación con los ratones no tratados (prueba t de student de dos colas).

Información de Apoyo Fig. S4. La T4 induce un bajo estatus energético en el músculo esquelético. (A) Western blots indicando la activación de la AKT en el músculo esquelético y el hígado de los ratones tratados o no con T4. Los animales se mantuvieron en ayunas durante 16 horas y fueron inyectados o no con insulina (0.75 Ul.kg"1 de peso corporal) 15 minutos antes de la eutanasia, n = 5 no tratados; n = 6 tratados con T4. (B) Determinación de los niveles de mRNA de genes involucrados en el metabolismo energético en el músculo esquelético de ratones tratados o no con T4. Los valores fueron normalizados a los ratones no tratados. GLUT2; n = 5 no tratados, n = 6 tratados con T4. GK; n = 5 no tratados, n = 6 tratados con T4. G6Pase; n = 5 no tratados, n =6 tratados con T4. LPK; n = 5 no tratados, n = 6 tratados con T4. PEPCK; n = 5 no tratados, n = 6 tratados con T4. GAPDH; n = 6. LDH; n = 5 no tratados, n = 6 tratados con T4. PGC1 a; n = 6. ΡΰΟΙ β; n = 6. UCP2; n = 5. SREBPIc; n = 5 no tratados, n = 6 tratados con T4. (C) Determinación de los niveles de mRNA de genes involucrados en el metabolismo energético del hígado en ratones tratados o no con T4. GLUT2; n = 5 no tratados, n = 6 tratados con T4. GK; n = 5. G6Pase; n = 5no tratados, n =6 tratados con T4. LPK; n = 5 no tratados, n = 6 tratados con T4. PEPCK; n = 5 no tratados, n = 6 tratados con T4. GAPDH; n = 6 no tratados, n = 5 tratados con T4. LDH; n = 5. PGC1a; n = 5 no tratados, n = 6 tratados con T4. PGC^; n = 6. UCP2; n = 6 no tratados, n = 5 tratados con T4. SREBPIc; n = 6 no tratados, n = 5 tratados con T4. (D) Western blots indicando la activación de AMPK en el músculo esquelético y el hígado de ratones tratados o no con T4. Los animales se mantuvieron en ayunas 16 horas antes de la eutanasia, n = 5 por grupo. (E) Análisis desintomético de los western blots realizados en los extractos de músculo esquelético mostrados en la Información de Apoyo Figura S4D. (F) Análisis desintomético de los western blots realizados enlos extractos de hígado mostrados en la Información de Apoyo Figura S4D. Los valores fueron normalizados a los ratones no tratados. UT: No tratados; T4: tratados con T4. Los datos están representados como la media ± SEM (error estándar de la media). * p < 0.05 en comparación con los ratones no tratados (prueba t de student de dos colas).

Información de Apoyo Fig. S5. La suplementación con T4 incrementa los niveles de T4 en la circulación, altera el peso de los órganos y modula la señalización de la insulina en los ratones RIP-B7.1 inmunizados. (A) Niveles de T4 en la circulación en condiciones postpandriales. n = 9 no tratados; n = 8 tratados con T4. (B) Peso de diferentes órganos divididos por el peso corporal, n = 6 no tratados; n = 9 tratados con T4. (C) Western blots indicando los niveles de pTyr632 IRS1 , IRS1 total y GAPDH, usado como control de carga, en el músculo esquelético y los hígados de los ratones RIP-B7.1 tratados o no con T4. Músculo esquelético n = 6 no tratados, n= 5 tratados con T4. Hígado n = 6 por grupo. (D) Análisis desintomético de los western blots realizados usando los extractos de músculo esquelético mostrados en la Información de Apoyo Figura S5C. Los valores fueron normalizados a los ratones no tratados. (E) Análisis desintomético de los western blots realizados usando los extractos de hígado mostrados en la Información de Apoyo Figura S5C. Los valores fueron normalizados a los ratones no tratados. UT: No tratados; T4: tratados con T4. Los datos están representados como la media ± SEM (error estándar de la media). * p < 0.05 en comparación con los ratones no tratados {prueba t de student de dos colas).

Información de Apoyo Fig. S6. Los ratones RIP-B7.1 inmunizados tratados o no con T4 presentan un grado similar de insulitis. (A) Imágenes representativas de la infiltración de células inmunes en los islotes pancreáticos de los ratones RIP-B7.1 inmunizados tratados o no con T4. (B) El nivel de insulitis fue evaluado como: grado 0-4 según el porcentaje de área infiltrada en el islote (0: 0%; 1 : <10%; 2: >10% and <55%; 3: >55% y <75%; 4: >75%). Barra de escala = 50 μηι. n = 5 por grupo. UT: No tratados; T4: tratados con T4. Los datos están representados como la media ± SEM (error estándar de la media). * p < 0.05 en comparación con los ratones no tratados {prueba t de student de dos colas).

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

En los ejemplos de la presente invención, se muestra si una suplementación a largo plazo con T4 aumenta el aclaramiento de la glucosa en ratones de tipos silvestre C57BL/6 estimulados o no con estreptozotocina y mejora la homeostasis metabólica en el modelo RIP-B7.1 de Diabetes Mellitus Tipo 1 (T1 DM) experimental (ET1 DM). Se determinó que la T4 mejora el control metabólico en ambos modelos murinos a través de la inducción de la proliferación de células β pancreáticas, así como de la producción de insulina, la cual se asoció con mayores niveles de insulina circulante y la subsiguiente activación del eje IRS1-AKT de la señalización de la insulina en los tejidos diana de la hormona.

Los autores de la presente invención han demostrado que la suplementación a largo plazo con levotiroxina incrementa el aclaramiento de la glucosa y reduce la glucosa circulante en ratones C57BL/6. Además, la levotiroxina aumenta simultáneamente la proliferación y la apoptosis de las células β pancreáticas, promoviendo el mantenimiento de una población de células 3 que expresan una cantidad alta de insulina. La levotiroxina aumenta los niveles de insulina circulante, induciendo la activación sostenida de la señalización IRS1-AKT en los tejidos diana e la insulina. Los ratones C57BL/6 tratados con levotiroxina sometidos a tratamiento con estreptozotocina mostraron una supervivencia prolongada. La levotiroxina bloquea el inicio de ET1 DM en ratones RIP-B7.1 mediante la inducción de la proliferación de células β y la preservación de células que expresan insulina.

Es decir, en los ejemplos de la presente invención se demuestra que:

1) El tratamiento con levotiroxina aumenta la proliferación y supervivencia de las células beta pancreáticas, que son las productoras de insulina, en dos modelos experimentales de diabetes tipo 1.

2) El tratamiento con levotiroxina aumenta la expresión de la glucokinasa en las células beta pancreáticas. Una mayor expresión de glucokinasa hace que se libere insulina a la circulación a una concentración menor de glucosa en sangre, lo que puede proteger contra los picos de glucosa, que son muy dañinos.

USOS MÉDICOS DE LA INVENCIÓN

Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere a las hormonas tiroideas (TH) y tiromiméticos para su uso en la prevención, mejora y tratamiento de la Diabetes Mellitus Tipo 1 (T1 DM).

En una realización preferida de este aspecto de la invención, las TH se seleccionan de entre tiroxina (T4) y triyodotironina (T3), o cualquiera de sus sales, ésteres, tautómeros, profármacos, solvatos e hidratos farmacéuticamente aceptables, así como derivados y análogos.

La descarboxilación y la desaminación de la hormona tiroidea conduce a una serie de metabolitos, denominados colectivamente como análogos de ácido acético. Estos compuestos incluyen el ácido triyodotiroacético (triac) y el ácido tetrayodotiroacético.

Uno de los primeros análogos de las hormona tiroideas sintetizados químicamente fue el ácido 3,5-diiodotiropropiónico (DIPTA).

Entre los derivados y análogos de la T3 se encuentran, pero sin limitarse, el ácido 3,5,3' triyodotiroacético (triac), la T3 reversa y glucagon/T3 conjugado.

Entre los derivados y análogos de T4 se encuentran, pero sin limitarse, el ácido tetrayodotiroacético (tetrac).

Entre los tiromiméticos se encuentran, pero sin limitarse, 3,5-diiodotironina (72), 3,3'-diiodotironina (3,3'-T2), ácido 3,5,3'-triiodotiropropionico (Triprop).

En otra realización preferida de este aspecto de la invención, los tiromimético se seleccionan de la lista que consiste en: ácido 3,5,3'- triyodotiroacético (triac), ácido tetraiodotiroacético (tetrac), tirinaminas, T3 reversa ó inversa, 3,5-diyodo-l-tiroina y glucagón conjugado/T3, ácido triyodotiroacético (triac), el ácido tetrayodotiroacético, ácido 3,5-diiodotiropropiónico (DIPTA), sobetirome o GC-1 , KB141 , KB2115 o eprotirome, MB0781 1 , MB07344, 3,5-diiodotironina (T2), 3,3'-diiodotironina (3,3'-T2) y ácido 3,5,3'-triiodotiropropionico (Triprop), o cualquiera de sus sales, ésteres, tautómeros, profármacos, solvatos e hidratos farmacéuticamente aceptables, así como derivados y análogos.

Los compuestos de la presente invención pueden incluir isómeros, dependiendo de la presencia de enlaces múltiples, incluyendo isómeros ópticos o enantiómeros, dependiendo de la presencia de centros quirales. Los isómeros, enantiómeros o diastereoisómeros individuales y las mezclas de los mismos caen dentro del alcance de la presente invención, es decir, el término isómero también se refiere a cualquier mezcla de isómeros, como diastereómeros, racémicos, etc., incluso a sus isómeros ópticamente activos o las mezclas en distintas proporciones de los mismos. Los enantiómeros o diastereoisómeros individuales, así como sus mezclas, pueden separarse mediante técnicas convencionales.

Asimismo, dentro del alcance de esta invención se encuentran los profármacos de los compuestos de la invención. El término "prodroga" o "profármaco" tal como aquí se utiliza incluye cualquier derivado de un compuesto de la invención -por ejemplo y no limitativamente: ésteres (incluyendo ésteres de ácidos carboxílicos, ésteres de aminoácidos, ésteres de fosfato, ésteres de sulfonato de sales metálicas, etc.), carbamatos, amidas, etc.-

que al ser administrado a un individuo puede ser transformado directa o indirectamente en dicho compuesto de la invención en el mencionado individuo. Ventajosamente, dicho derivado es un compuesto que aumenta la biodisponibilidad del compuesto de la invención cuando se administra a un individuo o que potencia la liberación del compuesto de la invención en un compartimento biológico.

La naturaleza de dicho derivado no es crítica siempre y cuando pueda ser administrado a un individuo y proporcione el compuesto de la invención en un compartimento biológico de un individuo. La preparación de dicho profármaco puede llevarse a cabo mediante métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia.

Tal como aquí se utiliza, el término "derivado" incluye tanto a compuestos farmacéuticamente aceptables, es decir, derivados del compuesto de la invención que pueden ser utilizados en la elaboración de un medicamento o composiciones alimentarias, como derivados farmacéuticamente no aceptables, ya que éstos pueden ser útiles en la preparación de derivados farmacéuticamente aceptables.

Los compuestos de la invención pueden estar en forma cristalina como compuestos libres o como solvatos. En este sentido, el término "solvato", tal como aquí se utiliza, incluye tanto solvatos farmacéuticamente aceptables, es decir, solvatos del compuesto de la invención que pueden ser utilizados en la elaboración de un medicamento, como solvatos farmacéuticamente no aceptables, los cuales pueden ser útiles en la preparación de solvatos o sales farmacéuticamente aceptables. La naturaleza del solvato farmacéuticamente aceptable no es crítica siempre y cuando sea farmacéuticamente aceptable. En una realización particular, el solvato es un hidrato.

Los solvatos pueden obtenerse por métodos convencionales de solvatacion conocidos por los expertos en la materia.

Para su aplicación en terapia, los compuestos de fórmula (I) y/o (II), sus sales, profármacos o solvatos, se encontrarán, preferentemente, en una forma farmacéuticamente aceptable o sustancialmente pura, es decir, que tiene un nivel de pureza farmacéuticamente aceptable excluyendo los aditivos farmacéuticos normales tales como diluyentes y portadores, y no incluyendo material considerado tóxico a niveles de dosificación normales. Los niveles de pureza para el principio activo son preferiblemente superiores al 50%, más preferiblemente superiores al 70%, y todavía más preferiblemente superiores al 90%. En una realización preferida, son superiores al 95% de compuesto de la invención, o de sus sales, solvatos o profármacos.

Un segundo aspecto de la invención se refiere a una composición, de ahora en adelante composición de la invención, que comprende las TH y los tiromiméticos según se han descrito en el primer aspecto de la invención, para su uso en el tratamiento de la T1 DM. En una realización preferida, además comprende un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. En otra realización preferida la composición de la invención es una composición farmacéutica. En otra realización preferida, además comprende otro principio activo.

Los adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden ser utilizados en dichas composiciones son los adyuvantes y vehículos conocidos por los técnicos en la materia y utilizados habitualmente en la elaboración de composiciones terapéuticas.

En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad del agente o compuesto capaz de desarrollar la acción terapéutica determinada por sus propiedades farmacológicas, calculada para producir el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, entre otras causas, por las características propias de los compuestos, incluyendo la edad, estado del paciente, la severidad de la alteración o trastorno, y de la ruta y frecuencia de administración.

Los compuestos descritos en la presente invención, sus sales, profármacos y/o solvatos así como las composiciones farmacéuticas que los contienen pueden ser utilizados junto con otros fármacos, o principios activos, adicionales para proporcionar una terapia de combinación. Dichos fármacos adicionales pueden formar parte de la misma composición farmacéutica o, alternativamente, pueden ser proporcionados en forma de una composición separada para su administración simultánea o no a la de la composición farmacéutica que comprende un compuesto de la invención, o una sal, profármaco o solvato del mismo.

Por tanto, en otra realización preferida, la composición farmacéutica además comprende otro principio activo.

Como se emplea aquí, el término "principio activo", "substancia activa", "substancia farmacéuticamente activa", "ingrediente activo" ó "ingrediente farmacéuticamente activo" significa cualquier componente que potencialmente proporcione una actividad farmacológica u otro efecto diferente en el diagnóstico, cura, mitigación, tratamiento, o prevención de una enfermedad, o que afecta a la estructura o función del cuerpo del hombre u otros animales. El término incluye aquellos componentes que promueven un cambio químico en la elaboración del fármaco y están presentes en el mismo de una forma modificada prevista que proporciona la actividad específica o el efecto.

En otra realización preferida de este aspecto, la composición de la invención consiste en un tiromimético o una hormona tiroidea según se describe en la invención como único principio activo, aunque puede contener excipientes y vehículos farmacéuticamente aceptables.

Un tercer aspecto de la invención se refiere a una forma farmacéutica, de ahora en adelante forma farmacéutica de la invención, que comprende las TH o tiromiméticos de la invención, o de la composición de la invención, para su uso en el tratamiento de la T1 DM.

En esta memoria se entiende por "forma farmacéutica" la mezcla de uno o más principios activos con o sin aditivos que presentan características físicas para su adecuada dosificación, conservación, administración y biodisponibilidad. En otra realización preferida de la presente invención, las composiciones y formas farmacéuticas de la invención son adecuadas para la administración oral, en forma sólida o líquida. Las posibles formas para la administración oral son tabletas, cápsulas, siropes o soluciones y pueden contener excipientes convencionales conocidos en el ámbito farmacéutico, como agentes agregantes (p.e. sirope, acacia, gelatina, sorbitol, tragacanto o polivinil pirrolidona), rellenos (p.e. lactosa, azúcar, almidón de maíz, fosfato de calcio, sorbitol o glicina), disgregantes (p.e. almidón, polivinil pirrolidona o celulosa microcristalina) o un surfactante farmacéuticamente aceptable como el lauril sulfato de sodio. Otras formas farmacéuticas pueden ser los sistemas coloidales, dentro de los cuales se incluyen nanoemulsiones, nanocápsulas y nanopartículas poliméricas.

Las composiciones para administración oral pueden ser preparadas por métodos los convencionales de Farmacia Galénica, como mezcla y dispersión. Las tabletas se pueden recubrir siguiendo métodos conocidos en la industria farmacéutica. Las composiciones y formas farmacéuticas se pueden adaptar para la administración parenteral, como soluciones estériles, suspensiones, o liofilizados de los productos de la invención, empleando la dosis adecuada. Se pueden emplear excipientes adecuados, como agentes tamponadores del pH o surfactantes.

Las formulaciones anteriormente mencionadas pueden ser preparadas usando métodos convencionales, como los descritos en las Farmacopeas de diferentes países y en otros textos de referencia.

El término "medicamento", tal y como se usa en esta memoria, hace referencia a cualquier sustancia usada para prevención, diagnóstico, alivio, tratamiento o curación de enfermedades en el hombre y los animales.

La administración de los compuestos, composiciones o formas farmacéuticas de la presente invención puede ser realizada mediante cualquier método adecuado, como la infusión intravenosa y las vías oral, tópica o parenteral. La administración oral es la preferida por la conveniencia de los pacientes y por el carácter crónico de las enfermedades a tratar.

La cantidad administrada de un compuesto de la presente invención dependerá de la relativa eficacia del compuesto elegido, la severidad de la enfermedad a tratar y el peso del paciente. Sin embargo, los compuestos de esta invención serán administrados una o más veces al día, por ejemplo 1 , 2, 3 ó 4 veces diarias, con una dosis total entre 0.1 y 1000 mg/Kg/día. Es importante tener en cuenta que puede ser necesario introducir variaciones en la dosis, dependiendo de la edad y de la condición del paciente, así como modificaciones en la vía de administración.

Los compuestos y composiciones de la presente invención pueden ser empleados junto con otros medicamentos en terapias combinadas. Los otros fármacos pueden formar parte de la misma composición o de otra composición diferente, para su administración al mismo tiempo o en tiempos diferentes.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

EJEMPLOS DE LA INVENCIÓN

Materiales y métodos

Cegamiento, tamaño de grupo y aleatorización

El analista de datos fue ciego, mientras que el operador no era ciego en la asignación de grupo de animales. Se seleccionaron ratones del grupo elegibles para su inclusión en el estudio y se dividieron aleatoriamente en los grupos experimentales (n = 26 ratones no tratados y n = 28 ratones tratados con T4 para ratones C57BL/6, n = 8 para el grupo sin tratamiento y n = 9 para el grupo tratado con T4 para ratones RI P-B7.1 , n = 9 para el grupo no tratado y n = 9 para el grupo tratado con T4 para ratones C57BL/6 tratados con estreptozotocina). El número de repeticiones biológicas fue similar (n sin tratamiento = n ± 1 tratado con T4) en los diferentes experimentos, la pérdida experimental condujo a mayores diferencias en el número de repeticiones biológicas dentro de los diferentes grupos experimentales en los experimentos mostrados en los paneles 1 L, 2A, 2B, 2D, 2E, 5B y S5B. El análisis cuantitativo de la expresión de genes y proteínas se normalizó a la media del grupo de control para facilitar la representación y la comprensión de los resultados. Los datos de la PCR cuantitativa se ajustaron usando un gen de referencia (β-actina). Los experimentos mostrados en los paneles de las figuras S1 B-E se normalizaron a los niveles de glucosa en el tiempo 0 (%) para determinar si las diferencias en las pruebas metabólicas provienen de las diferencias en los niveles básales de glucosa (Curtís et al., 2015). Los valores reales de glucosa se muestran en los paneles de las figuras 1A, 1 E, 1 G y 11.

Cumplimiento de los requisitos para los estudios con animales

Los animales se mantuvieron de acuerdo con las directrices del Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa (CABIMER), Unión Europea, ARRRIVE y The British Journal of Pharmacology. La instalación animal CABIMER proporciona los recursos necesarios en las condiciones exigidas por la legislación nacional y de la Unión Europea (RD español 53/2013 y Directiva UE 2010/63) para la protección de animales utilizados con fines científicos. La instalación de animales CABIMER es una instalación certificada SPF (libre de patógenos específicos). Los ratones fueron alojados en jaulas ventiladas individualmente (Tecniplast). Souralit plus 29/12 (Souralit) se esterilizó en autoclave y se añadió a cada jaula. Los ratones se alojaron en grupos (1-4 ratones por jaula), se mantuvieron en un ciclo de luz / oscuridad de 12 horas y tuvieron acceso a comida de roedor TD2914 (Envigo) y agua ad libitum.

Para los experimentos en ratones C57BL/6, se utilizó la descendencia de 5 pares de ratones (Janvier). Los ratones C57BL/6 se consideran un modelo óptimo para estudiar la homeostasis de la glucosa. Los ratones hembra fueron tratados o no con T4 desde el nacimiento (inyección diaria de 18 ng.g"1 de peso corporal hasta el destete). Después del destete, los ratones se suplementaron con T4 en el agua potable (50 μg.mΓ1 de T4) (Sigma- Aldrich) (Dong et al. , 2010, Spencer y West, 1961 , Mysliwiec et al., 201 1 , Weinstein et al. , 1994, Weinstein et al., 1991 , Buras et al., 2014, Wistuba et al., 2007). 5 animales no tratados y 6 animales tratados con T4 por grupo fueron inyectados con insulina (0,75 U.Kg"1 de peso corporal) antes de la eutanasia. A las 24 semanas de edad, los animales se mantuvieron en ayunas durante 16 horas y fueron sacrificados por dislocación cervical.

Para experimentos relacionados con la diabetes autoinmune experimenta, se usaron ratones RIP-B7.1 transgénicos (Mellado-Gil et al., 2016, Harían et al., 1994). Los ratones RIP-B7.1 son un modelo bien establecido de ET1 DM. Se inició la administración de T4 (5 μg.ml-1 de T4 en el agua potable) a las 6 semanas de edad. La ET1 DM se desencadenó mediante inmunización intramuscular a las 8 semanas de edad con 50 μg de ADN plasmídico pC1 / ppins (1 μ9.μΙ-1) que albergaba la preproinsulina II. A las 11 semanas de edad se les practicó la eutanasia los animales por dislocación cervical. Para experimentos relacionados con la diabetes mellitus inducida por un producto químico, se utilizó estreptozotocina. Se trataron ratones C57BL/6 machos de 34 semanas de edad con T4 (5 μg.ml-1 de T4 en el agua potable). A las 2 semanas de tratamiento con T4, la diabetes mellitus se desencadenó mediante inyecciones intraperitoneales múltiples (durante 2 días consecutivos) de estreptozotocina (150 mg/kg de peso corporal) (Sigma-Aldrich), recién disueltas en tampón de citrato de Na 10 mM (pH 4,5). Se practicó la eutanasia a los ratones si los niveles de glucosa circulante estaban por encima de 500 mg.dl-1 durante más de 96 horas.

Inmunohistoquímica

Los tejidos disecados se fijaron en paraformaldehído al 4%. Las secciones pancreáticas de 7 μηι de grosor fueron desparafinadas y rehidratadas. La recuperación de antígeno se realizó en tampón de citrato de sodio 0,01 M (pH 6). Después de 1 hora de bloqueo a temperatura ambiente, las secciones se incubaron durante una noche a 4 0 C con anticuerpos primarios (Tabla de Información de Apoyo S1). Posteriormente, los portaobjetos se incubaron con anticuerpos secundarios (Tabla de información de soporte S1) durante 1 hora a temperatura ambiente. Para inmunofluorescencia, se utilizó una tinción nuclear con DAPI (Life Technologies, España). Para la tinción con diaminobencidina (DAB), se utilizaron anticuerpos secundarios biotinilados (VectorLab) y se realizó la contratinción con Hematoxilina (Panreac). La tinción con insulina se cuantificó usando el software Imagen J como valor medio/píxel después de la sustracción del fondo. Las secciones del tiroides y la pituitaria se tiñeron con hematoxilina y eosina (Panreac).

RT-PCR semi-cuantitativa

El ARN total se extrajo de muestras de músculo esquelético y de hígado congelados usando el kit de extracción de ARN Easy-blue (Intron Biotechnologies). Para los experimentos con islotes se utilizó el RNeasy Micro Kit (Qiagen). El ADN complementario se sintetizó utilizando Superscript II (Invitrogen). La RT-PCR se realizó en cDNAs individuales utilizando SYBR green (Roche). Las secuencias de los cebadores se presentan en la Tabla de Información de Apoyo S2. La expresión de mRNA se calculó mediante el método 2_AAC7 y se normalizó a la expresión de β-actina.

Western blot

Las muestras se lisaron en tampón de ensayo de radioimmunoprecipitación (Tris-HCI 20 mM (pH 7,5), NaCI 150 mM, Na2EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, NP-40 al 1 %, desoxicolato sódico al 1 %) con inhibidores de proteasa, fosfastida y desacetilasa P0044, P5725, P8340 (Sigma -Aldrich) y SC - 362323 (Santa Cruz Biotechnology). Los Western blots se realizaron de acuerdo con métodos estándar, lo que implicó la incubación con el anticuerpo primario de interés, seguido de incubación con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano (Tabla de Información de Apoyo S1). Los Blots fueron cuantificados con ImageJ y las bandas de interés se normalizaron al Ponceau S y/o tinción GAPDH, como previamente se había validado (Bello et al., 2003).

Determinaciones in vivo de insulina y glucosa

Para determinar los niveles de glucosa, se tomaron muestras de sangre por punción venosa usando un glucómetro Precisión Xceed (Abbott) (Martin-Montalvo et al., 2013). La insulina se midió en plasma usando kits de ELISA (Crystal Chem). Para el OGTT, los ratones se mantuvieron en ayunas durante 6 horas a las 10 Ante Meridian (AM) y recibieron una dosis oral de 3 g.kg"1 de peso corporal de glucosa (Sigma-Aldrich) por sonda. Para el IPPTT, los ratones se mantuvieron en ayunas durante 6 horas a las 10 AM y recibieron una dosis oral de 2 g.kg"1 de peso corporal de piruvato de sodio (Sigma-Aldrich) por sonda. Para el ITT, los ratones se mantuvieron en ayunas durante 3 horas a las 10 AM y recibieron una dosis intraperitoneal de 0,75 lU.kg"1 de peso corporal de insulina. Para la determinación de glucosa durante un período de ayuno de 24 horas, los ratones fueron ayunados a las 8 Post Meridian.

Test de Rotarod

Los resultados de las pruebas del rotarod se presentan como el tiempo en caer de un rotarod en aceleración, como se ha descrito previamente (4-40 rpm durante 5 min) (Mitchell et al., 2014). A los ratones se les sometió a un ensayo de habituación de 1 minuto a 4 rpm el día antes del experimento. Los resultados mostrados son los promedios de 3 ensayos por ratón.

Aislamiento de islotes, el cultivo y la secreción de insulina estimulada por glucosa (GSIS)

Se aislaron islotes de ratones C57BL/6 de tipo silvestre de 24 semanas de edad mediante la perfusión intraductal de colagenasa, como se ha descrito anteriormente (Jiménez-Moreno et al., 2015). Para las RT-PCR semicuantitativas, islotes pancreáticos fueron congelados instantáneamente tras la recolección. Para la determinación de insulina se lisaron cantidades similares de equivalentes de islotes (10 en cada replicación técnica) en HCI-etanol (HCI al 5% en etanol 96°) y se mantuvieron durante una noche a 4 °C. Para los estudios de GSIS se cultivaron los islotes durante una noche en medio RPMI-1640 2 gl"1 de glucosa). Después, se lavaron grupos de 10 islotes en 500 μΙ de tampón bicarbonato-HEPES de Krebs-Ringer (KRBH) (NaCI 140 mM, KCI 3,6 mM, NaH2P04 0,5 mM, MgS04 0,5 mM, CaCI2 1 ,5 mM, NaHC03 2 mM, HEPES 10 mM , BSA al 0, 1 %). Posteriormente, se añadió KRBH fresco, suplementado con glucosa 2,8 mM y se incubaron los islotes durante 30 minutos. A continuación, se recogió el tampón (secreción de insulina 2,8 mM) y se añadieron 500 μΙ de KRBH suplementado con 22 mM de glucosa. Los islotes se incubaron durante 30 minutos adicionales a 37°C y después se recogió el tampón (secreción de insulina 22 mM). Después de las incubaciones, los islotes se lisaron con HCI-Etanol para obtener el contenido de insulina. En todos los casos se midió la insulina usando kits de ELISA (Crystal Chem).

Determinación de T4

La concentración de T4 en suero se determinó usando un equipo comercial T4 (MP Biomedicals).

Modelo de evaluación de homeostasis de la resistencia a la insulina (HOMA-IR).

La resistencia a la insulina se estimó utilizando el calculador HOMA2 disponible en el sitio web de Oxford (Levy et al., 1998).

Hemoglobina glicosilada

Los niveles de HbA1c se determinaron en muestras de sangre de acuerdo con el protocolo del fabricante (CrystalChem).

Determinación de la subunidad ct-glicoproteína (ct-GSU)

La α-GSU de hormonas pituitarias se determinó usando un kit comercialmente disponible siguiendo las instrucciones del fabricante (Abbexa).

Ensayo de túnel

Para la tinción con TUNEL, el kit de detección de muerte celular in situ, Fluorescein se usó usando proteinasa K (Sigma-Aldrich).

Materiales

Se adquirió T4 de (Sigma - Aldrich). A menos que se indique lo contrario, los reactivos se adquirieron de Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich).

Estadística

Los datos y el análisis estadísticos en este estudio cumplen con las recomendaciones sobre diseño experimental y análisis en farmacología (Curtís et al., 2015). La significancia estadística se calculó utilizando la prueba t de Student de dos colas no apareada, ya que se compararon 2 grupos experimentales (no tratados y tratados con T4) (Excel 2007, Microsoft). La prueba de la suma de rangos de Mann-Whitney se aplicó cuando los datos se normalizaron a los niveles básales de glucosa (SigmaPlot 12.5, Softonic). Se aplicó una prueba estadística de LogRank para las curvas de supervivencia (SigmaPlot 12.5, Softonic). Para todos los análisis, * p <0,05 se consideró estadísticamente significativo. Los errores representan el error estándar de la media (SEM).

Resultados

La suplementacion con T4 incrementa el aclaramiento de la glucosa en ratones C57BL/6 sanos.

Con el fin de determinar los efectos metabólicos de la suplementacion con T4 en ratones, se trataron ratones C57BL/6 de tipo silvestre del sexo femenino con T4 a partir del día postnatal 1 (18 ng.g-1 de peso corporal. dia-1 , inyecciones subcutáneas) hasta el destete, seguido por la administración de T4 en el agua potable (50 μg.ml-1 ad libitum) hasta las 24 semanas de edad, cuando los ratones fueron sacrificados (Dong et al., 2010, Spencer y West, 1961 , Mysliwiec et al., 201 1 , Weinstein et al., 1994, Weinstein et al., 1991 , Buras et al., 2014, Wistuba et al., 2007). El análisis de las muestras de suero indicó que la concentración de T4 se incrementó en los ratones tratados con T4 (Información de apoyo de la Figura S1A).

La tolerancia a la glucosa se incrementó mediante la suplementacion de T4, determinada por el área bajo la curva inferior en una prueba oral de tolerancia a la glucosa (OGTT), incluso cuando los niveles de glucosa se expresaron como el porcentaje de la glucosa basal (Figura 1A-B y Figura S1 B). Notablemente, los niveles básales de insulina circulante fueron mayores en los ratones tratados con T4 en el OGTT, mientras que en los 15-30 minutos post-carga de glucosa, los niveles fueron similares a los de los animales no tratados (Figura 1 C-D). Los niveles de glucosa también fueron menores en todos los puntos de tiempo medidos durante una prueba de tolerancia al piruvato intraperitoneal (IPPTT), lo que indica que la gluconeogénesis hepática, aunque significativa (por ejemplo, un aumento significativo en los niveles de glucosa promovidos por la administración de piruvato), no es capaz de normalizar los niveles de glucosa en los ratones tratados con T4 (Figura 1 E-F e Información de Apoyo Figura S1C). Con el fin de determinar si la sensibilidad a la insulina estaba afectada, se realizó una prueba de tolerancia a la insulina (ITT) a los animales. Los niveles de glucosa en circulación fueron significativamente más bajos en los ratones tratados con T4 en cualquier momento durante el ITT, aunque las diferencias se derivaron de la menor glucosa basal, determinada por la falta de diferencias significativas cuando los niveles de glucosa se expresaron como el porcentaje de glucosa basal (1 G-H e información de apoyo Figura S1 D). Después se midieron los niveles de glucosa en circulación durante un período de ayuno de 24 horas. Los niveles de glucosa se redujeron significativamente en los ratones tratados con T4 en cualquier momento durante el experimento (Figura 1 l-J y la información de apoyo de la Figura S1 E). Consistente con los altos niveles de insulina determinados durante el tiempo basal del OGTT (ayuno de 6 horas), los niveles de insulina circulantes también fueron mayores a las 16 horas de ayuno (Figura 1 K). Curiosamente, a pesar de los niveles más bajos de glucosa durante el ITT, se encontró una tendencia hacia el aumento de HOMA-IR en los ratones tratados con T4 (p = 0,08 en la prueba t de Student de dos colas). Apoyando la reducción a largo plazo de los niveles de glucosa en ratones tratados con T4, se encontró que el porcentaje de hemoglobina glicosilada era menor (nótese que el grupo no tratado está dentro del rango fisiológico saludable, ~ 5%) (Figura 1 L). En conjunto, estos resultados indican que la suplementacion con T4 reduce drásticamente la concentración de glucosa en sangre, asociado con un aumento de la insulina circulante.

A continuación, se evaluó el impacto de la suplementacion de T4 en la fisiología del cuerpo entero. El peso corporal se redujo ligeramente en ratones tratados con T4 (Figura 2A). Además, la suplementacion con T4 mejoró considerablemente el rendimiento en el rotarod, lo que indica el estado general saludable de los animales (Figura 2B]. Curiosamente, la ingesta de energía fue similar en ambos grupos experimentales, incluso cuando se dividió por el peso corporal (Figura 2C y la información de apoyo de la Figura S2A). Significativamente, en el momento de la eutanasia, tanto el peso del tejido adiposo blanco gonadal (WAT) como el peso del tiroides era inferior en ratones tratados con T4 (Figura 2D-E). Por el contrario, se encontró que varios órganos, incluido el tejido adiposo marrón (BAT), eran más pesados en los ratones tratados con T4, incluso al ser divididos por el peso corporal (Figura 2 D-E). Los estudios histológicos del tiroides y la pituitaria no revelaron cambios macroscópicos importantes en la morfología de los tejidos (Información de apoyo Figura S2B). Notablemente, las secciones del tiroides de ratones tratados con T4 tuvieron una tinción ligeramente menos intensa del coloide en el lumen del folículo, lo que sugiere un contenido reducido de tiroglobulina endógena. Además, la concentración sérica de la subunidad-α glicoproteína (α-GSU) de las hormonas pituitarias se redujo concomitantemente en los ratones tratados con T4 (Figura de Apoyo a la Información S2C).

La suplementacion con T4 aumenta el remplazo de las células β y aumenta el contenido de insulina de las células β

El aumento mediado por la T4 en los niveles circulantes de insulina indica un efecto potencial de la hormona en los islotes pancreáticos. Consecuentemente, la tinción con insulina fue mayor mientras que el glucagón no se vio afectado en secciones pancreáticas de ratones tratados con T4 en comparación con los ratones control (Figura 3A-C). El aumento del contenido de insulina en los islotes de ratones tratados con T4 se confirmó mediante determinación por ELISA utilizando islotes pancreáticos recién aislados (Figura 3D). Las determinaciones de la expresión de mRNA por PCR sem ¡cuantitativa en tiempo real en islotes pancreáticos de ratones tratados con T4 y no tratados indicaron que la expresión de AKT y glucoquinasa (GK) aumentó significativamente en los islotes de ratones tratados con T4, mientras que no se observaron cambios en la expresión génica de MAFA ni FOXO (información de apoyo figura S3A). El análisis inmunohistoquímico confirmó que la expresión de GK está incrementada en ratones tratados con T4 (Figura 3A y E). Sorprendentemente, los ensayos de GSIS realizados en islotes aislados de ratones tratados con T4, determinaron que la secreción de insulina se incrementaba cuando los islotes se cultivaban en condiciones de baja glucosa (2,8 mM) (Figura 3F). Sin embargo, las diferencias en la secreción de insulina bajo condiciones de alta glucosa (22 mM) no alcanzaron significación estadística. Los análisis de inmunofluorescencia de las secciones pancreáticas no mostraron cambios aparentes en la localización subcelular de FOX01 y MAFA, marcadores de la diferenciación / maduración y el metabolismo de las células β en ratones tratados con T4 (Aguayo-Mazzucato et al., 2013, Kikuchi et al., 2012). Curiosamente, la proliferación de células β, definida aquí como el porcentaje de células positivas Ki67 dentro de la población de células que expresan insulina, aumentó en animales tratados con T4 en comparación con ratones no tratados (Figura 3G-I). A diferencia de las células β, las células endocrinas pancreáticas que no expresan insulina mostraron una proliferación similar (porcentaje de células Ki67 positivas en células del islote que no expresan insulina) (Figura 3G e I). Sorprendentemente, el porcentaje de células apoptóticas, determinado por la tinción de Túnel, también se incrementó por la administración de T4, específicamente en la población de células β (Figura 3J-L).

La T4 induce la activación de la señalización IRS1-AKT en los tejidos diana de la insulina

Con el fin de determinar el mecanismo subyacente de la acción de la T4 en los tejidos diana de la insulina, se determinó la expresión de mRNA por PCR semi-cuantitativa en tiempo real. Encontramos que los niveles de transcripción de varios miembros de la vía de señalización de la insulina se sobreexpresan en el músculo esquelético y el hígado de ratones tratados con T4 (Figura 4A-B). En consonancia con estos datos, los extractos proteicos tanto del hígado como de músculo esquelético tratados con T4, mostraron niveles aumentados de AKT total, FOX01 y GSKS-β, entre otros (Figura 4 C-E). Por otra parte, las isoformas fosforiladas de varios miembros de la señalización de la insulina, tales como pTyr632 IRS1 , pSer473 AKT y pSer256 FOX01 , se incrementaron significativamente tanto en el músculo esquelético como en los lisados hepáticos aislados de ratones tratados con T4 (Figura 4 C-E). Sorprendentemente, la fosforilación de ERK en Thr202 / Tyr204 en el músculo esquelético se redujo en las muestras tratadas con T4, lo que indica la especificidad del efecto de la suplementacion de T4 en la rama IRS1-AKT de la señalización de la insulina. Con el fin de determinar si la suplementacion con T4 también podría aumentar la activación máxima del eje IRS1-AKT de la señalización de la insulina, una cohorte de ratones fue tratada con insulina (0,75 Ul.kg-1 de peso corporal) 15 minutos antes del sacrificio (Figura 4F -H e información de apoyo Figura S4A). No se encontraron diferencias en la fosforilación de AKT Ser473 estimulada por la insulina, lo que indica que la activación máxima de AKT incucida por la insulina no se ve afectada por el tratamiento con T4. El tratamiento con T4 también moduló la expresión de genes implicados en la utilización de la glucosa (por ejemplo, la glucólisis y gluconeogénesis) y el desacoplamiento mitocondrial, tanto en los músculos esqueléticos como en los hígados (Figura S4B-C). En conjunto, estos resultados sugieren que los altos niveles de insulina en la circulación inducidos por la T4 conducen a la activación sostenida de la señalización de IRS1-AKT y posterior aumento en la captación de glucosa en los tejidos diana de la insulina para mantener sus altos requerimientos metabólicos. Apoyando estos datos, se encontró un aumento significativo en la fosforilación de la Thr172 en la AMPK, que indica un bajo estatus energético, en extractos aislados de músculos esqueléticos tratados con T4 (Información de apoyo de la Figura S4D-E). Cabe destacar que esta regulación no fue detectada en muestras de hígado, lo que sugiere que el metabolismo energético es afectado, preferentemente, en tejidos con mayores requerimientos metabólicos (Información de Apoyo Figura S4D y F).

La suplementacion con T4 mejora el control glucémico en el modelo RIP-B7. 1 de diabetes autoinmune experimental

Teniendo en cuenta los efectos de la suplementacion con T4 en la inducción de la proliferación de las células β y el aumento de los niveles de insulina circulante en ratones C57BL/6 sanos, a continuación tratamos de determinar si la suplementacion con T4 podría bloquear el inicio de la T1 DM en el modelo RIP-B7.1 de ET1 DM (Mellado-Gil et al., 2016, Harían et al., 1994). Con este fin, ratones RIP-B7.1 fueron tratados con T4 (5 μ g.ml-1 en el agua potable), a partir de las 6 semanas de edad. Posteriormente, a las 8 semanas de edad, los ratones RIP-B7.1 fueron inmunizados para desencadenar el ataque autoinmune a las células β. La determinación de los niveles circulantes de T4 reveló un aumento significativo en los ratones RIP-B7.1 inmunizados tratados con T4 en comparación con los ratones RIP-B7.1 inmunizados no tratados (información de soporte, figura S5A).

Notablemente, los ratones RIP-B7.1 inmunizados tratados con T4 ganaron peso durante el transcurso del experimento, mientras que los ratones RIP-B7.1 inmunizados control (sin tratar) alcanzaron una meseta (Figura 5A). Así, los pesos corporales fueron significativamente diferentes a la semana 4 del tratamiento con T4. Al igual que los ratones C57BL/6 silvestres (Figura 2D-E), se encontró que el peso de varios órganos, incluyendo el tejido adiposo marrón, era mayor en el momento de la eutanasia (5 semanas de tratamiento con T4, 1 1 semanas de edad) (Figura 5B). Sin embargo, las diferencias en el peso del tejido adiposo blanco gonadal no fueron evidentes, incluso cuando se dividió por el peso corporal (Figura 5B y la información de apoyo de la Figura S5B).

Con el fin de determinar el efecto de la suplementacion con T4 en la patogénesis de ET1 DM, se realizaron varias pruebas metabólicas. El OGTT realizado 2 semanas después de la inmunización reveló una mejora en el aclaramiento de la glucosa en ratones RIP-B7.1 inmunizados tratados con T4 (Figura 5C-D). Un ITT realizado 3 semanas después de la inmunización, indicó que la glucosa circulante era significativamente menor en ratones RIP-B7.1 inmunizados tratados con T4 en cualquier tiempo medido durante el experimento (Figura 5E-F). Sin embargo, estas diferencias parecen provenir de los menores niveles básales de glucosa en ratones RIP-B7.1 tratados con T4. La determinación posprandial de glucosa reveló que, mientras que los animáis RIP-B7.1 inmunizados no tratados desarrollaron hiperglucemia a las 5 semanas de tratamiento (3 semanas después de la inmunización), los ratones RIP-B7.1 inmunizados tratados con T4 permanecieron

normoglicémicos (Figura 5G). Sorprendentemente, la insulina circulante postprandial se incrementó dramáticamente en ratones RIP-B7.1 inmunizados tratados con T4, lo que se asoció con un aumento de la fosforilación del IRS1 en pTyr632 en el hígado (Figura 5H e información de soporte). Con el fin de determinar si la suplementacion de T4 podría mejorar la glucoregulación en un modelo de investigación diferente, se utilizó un modelo de diabetes mellitus inducida químicamente por estreptozotocina. Para este fin, los ratones machos C57BL/6 de tipo silvestre se trataron con T4, (5 μg.ml-1 en el agua potable) comenzando 2 semanas antes de inyecciones intraperitoneales múltiples (durante 2 días consecutivos) de estreptozotocina. La supervivencia media de los ratones control tratados con estreptozotocina fue de 8 días, mientras que el grupo suplementado con T4 alcanzó una supervivencia media de 34 días (Figura 51, P <0,01 , χ2 = 7,689). Los niveles posprandiales de glucosa mostraron una tendencia hacia la reducción de la glucemia en los ratones tratados con T4 (Figura 5J). Tomados en conjunto, nuestros resultados indican que la T4 bloquea el inicio de la T1 DM en el modelo RIP-B7.1 de diabetes autoinmune experimental y promueve la supervivencia en la diabetes mellitus inducida por estreptozotocina.

Se realizaron análisis inmunohistoquímicos para determinar los efectos subyacentes de la suplementacion con T4 en el páncreas de ratones RIP-B7.1 inmunizados. Aunque los ratones RIP-B7.1 inmunizados no tratados y tratados con T4 mostraron un grado similar de infiltraciones de linfocitos, los ratones tratados con T4 mostraron un marcado incremento en la tinción de insulina sin variación significativa en la tinción con glucagón (Figura 6A-C y Figura S6). A continuación, se investigó si la T4 también podría aumentar la proliferación de las células β en el modelo RIP-B7.1 de T1 DM. Curiosamente, la abundancia de células positivas a Ki67 que residen en los islotes se incrementó en ratones RIP-B7.1 inmunizados en comparación con ratones C57BL/6 sanos, lo que indica que las células inmunitarias residentes en los islotes y / o células endocrinas pancreáticas proliferan bajo el ataque inmune (Figuras 3D y 6D). Sin embargo, los ratones RIP-B7.1 inmunizados tratados con T4 mostraron un marcado aumento en las células β proliferantes cuando se compararon con ratones RIP-B7.1 inmunizados no tratados (Figura 6D-E). Como se esperaba, el ataque inmunitario aumentó el porcentaje de células β apoptóticas en ratones RIP-B7.1 inmunizados tratados con T4 y no tratados (Figura 3G-H y 6F-G). Sin embargo, no se observaron diferencias entre ratones RIP-B7.1 inmunizados tratados con T4 y no tratados. Estos resultados sugieren que el aumento de la proliferación de las células β podría ser el mecanismo subyacente por el cual la T4 bloquea el inicio de la ET1 DM en ratones.