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1. (WO2019002655) METHOD FOR DESIGNING A PERSONALISED THERAPY FOR AN INDIVIDUAL SUFFERING FROM CISPLATIN-RESISTANT LUNG CANCER
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DESCRIPCION

Método para diseñar una terapia personalizada a un individuo que padece cáncer de pulmón resistente a cisplatino

La presente invención se refiere a un método in vitro para diseñar una terapia personalizada a un individuo que padece cáncer de pulmón resistente a cisplatino que comprende determinar el nivel de expresión del gen PGC-1alfa antes y después del tratamiento con cisplatino, en donde si el nivel de expresión de dicho gen es mayor después que antes del tratamiento, entonces la terapia después del tratamiento con cisplatino comprende la administración de un compuesto dirigido a disminuir la función OXPHOS. Por lo tanto, la presente invención se engloba dentro del campo del tratamiento del cáncer, más en concreto, en el tratamiento del cáncer de pulmón.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El cáncer de pulmón es el cáncer más extendido a lo largo del mundo en términos de incidencia y es la principal causa de muerte debida al cáncer. En la mayoría de los casos, la quimioterapia basada en cisplatino es el tratamiento estándar. Sin embargo, es frecuente que durante el tratamiento se desarrolle resistencia, limitando la utilidad clínica de este fármaco. Los mecanismos de resistencia del cisplatino son complejos, pues están implicadas diversas estrategias y rutas metabólicas. En los últimos años, un incremento en el metabolismo oxidativo ha sido sugerido como el mecanismo de acción común para muchos cánceres y la resistencia al tratamiento.

Aproximadamente, entre el 85% y el 90% de los diagnósticos de cáncer de pulmón son cáncer de pulmón de células no pequeñas o NSCLC (de sus iniciales en inglés Non-Small Cell Lung Cáncer). La clasificación actual de NSCLC tiene en cuenta alteraciones moleculares que pueden influir en la decisión terapéutica. Sin embargo, hasta el momento, no se dispone de un fármaco adaptado a las mutaciones que muestran la mayoría de los pacientes que sufren NSCLC y por lo tanto, la quimioterapia basada en platino es todavía la terapia estándar de elección.

Adicionalmente, aunque los tratamientos del cáncer de pulmón han progresado de forma significativa desde hace un tiempo, e incluso más recientemente con la aparición de la inmunoterapia, su relación coste- eficacia en comparación con los

tratamiento basados en cisplatino todavía es un reto a superar. Por lo tanto, el cisplatino es uno de los principales fármacos empleados en el tratamiento de NSCLC. Lamentablemente, es frecuente desarrollar quimio resistencia durante el tratamiento, o el tratamiento tiene que ser discontinuo debido a la toxicidad del platino lo que limita la utilidad clínica de este fármaco

Los mecanismos de resistencia al cisplatino son complejos. Aunque un metabolismo energético alterado es uno de los sellos distintivos del cáncer, poco se sabe de su papel en la quimio resistencia. Las mitocondrias son orgánulos conocidos por ser la central energética de la célula, responsables de la fosforilación oxidativa o OXPHOS (de sus iniciales en inglés oxidative phosphorilation). En este proceso, la acetil CoA a partir de la glicolisis o la oxidación de los ácidos grasos alimenta el ciclo de los ácidos tricarboxílicos (TCA) que genera cofactores reducidos. Estos cofactores transfieren electrones al sistema OXPHOS que a través de una cadena de reacciones redox reduce el oxígeno a agua. Algunas de estas reacciones producen especies reactivas del oxígeno (o ROS, de sus siglas en inglés Reactive Oxigen Species). Simultáneamente durante este proceso, los protones son bombeados dentro del espacio intermembrana generando lo que se conoce como el potencial de membrana interno mitocondrial o MIMP (de sus siglas en inglés Mitochondrial Inner Membrane Potential) que es finalmente disipado a través del complejo V generando ATP. La visión clásica del metabolismo tumoral se conoce como el efecto Warburg. Según esta teoría, las células tumorales incrementan su glicolisis aeróbica reduciendo la función OXPHOS con el objetivo de aumentar la provisión de intermediarios metabólicos usados en los procesos anabólicos. Sin embargo, bajo algunas circunstancias, las células tumorales tienen la habilidad de adaptar su metabolismo a los diferentes ambientes y tratamientos, incrementando su adaptabilidad y resistencia del tumor a las terapias.

Por lo tanto, existe en el estado de la técnica la necesidad de desarrollar nuevas estrategias terapéuticas que superen todos estos inconvenientes, y se mejore así la eficacia del tratamiento administrado el paciente.

DESCRIPCIÓNDE LA INVENCIÓN

Los inventores han encontrado que, en líneas celulares de pulmón, los niveles de expresión del gen PGC-1alfa se incrementan en respuesta al tratamiento con

cisplatino, dando lugar a que la célula se haga resistente a este fármaco, pero que, sorprendentemente, la viabilidad de esta célula disminuye tras la administración de un compuesto dirigido a disminuir la función OXPHOS, tales como metformina, rotenona o un ARN de interferencia del gen PGC-1alfa, llegando incluso a revertir dicha resistencia a cisplatino, volviendo la célula sensible a este fármaco.

Por lo tanto, este descubrimiento abre una nueva ventana terapéutica al tratamiento del cáncer de pulmón, en particular, al cáncer de pulmón que se muestra resistente al tratamiento con cisplatino, pues permite dirigir el tratamiento a las características especiales del individuo, evitando la administración de terapias no eficaces. Así, en base a este descubrimiento, se han desarrollado una serie de aspectos inventivos que serán descritos a continuación.

Método de la invención

En vista de lo anterior, en un aspecto la presente invención se relaciona con un método in vitro para diseñar una terapia personalizada a un individuo que padece cáncer de pulmón resistente a cisplatino que comprende

(a) determinar el nivel de expresión del gen PGC-1alfa antes y después del tratamiento con cisplatino en una muestra biológica aislada procedente de dicho individuo, y

(b) comparar el nivel de expresión obtenido en la etapa (a) antes del tratamiento con el nivel de expresión después del tratamiento,

en donde un nivel de expresión de PGC-1alfa después del tratamiento mayor que el nivel de expresión de PGC-1 alfa antes del tratamiento es indicativo de que la terapia después del tratamiento con cisplatino comprende la administración de un compuesto dirigido a disminuir la función OXPHOS.

En la presente invención se entiende por "terapia" o "tratamiento" a la administración a un individuo de un compuesto, o combinación de compuestos, con el objetivo de inhibir una enfermedad o condición patológica, es decir, detener su desarrollo; aliviar una enfermedad o condición patológica, es decir, causar la regresión de la enfermedad o la condición patológica; y/o estabilizar una enfermedad o condición patológica en un individuo. En la presente invención, la enfermedad o condición patológica es el cáncer de pulmón, en particular, cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC de sus

siglas en inglés non-small cell lung cáncer). En otra realización particular, el cáncer de pulmón es metastásico, más en particular, NSCLC en estado metastásico.

En la presente invención se entiende por "cáncer de pulmón" a aquella enfermedad, o conjunto de enfermedades, resultante del crecimiento incontrolado de las células del tracto respiratorio, en particular, del tejido pulmonar. En el contexto de la presente invención, el término "cáncer" también incluye el concepto de "tumores", entiendo éstos como un conjunto agregado de células resultante de la proliferación incontrolada de una única célula. La gran mayoría de los tipos de cáncer de pulmón son carcinomas, es decir, tumores malignos que nacen de células epiteliales. Hay dos formas de carcinoma pulmonar, categorizados por el tamaño y apariencia de las células malignas vistas histopatológicamente bajo un microscopio: los tumores de células no-pequeñas y los de células pequeñas. Así, ejemplos de cáncer de pulmón incluyen, sin limitar a, los adenocarcinomas, los carcinomas de células escamosas, los carcinomas de células grandes y los carcinomas de células pequeñas. Existen además los carcinomas bronquioalveolares y varias formas mixtas.

Asimismo, el cáncer de pulmón puede ser metastásico o no metastásico. En la presente invención se entiende por "cáncer de pulmón metastásico", a aquella etapa del desarrollo del cáncer en la que las células del tracto respiratorio cancerígenas, en particular, células pulmonares cancerígenas, invaden el torrente sanguíneo del individuo, llegando a los nodulos linfáticos, y colonizando otros tejidos distintos del tejido de origen.

Se considera que la terapia es "personalizada" cuando el/los compuesto/s que se va/n a administrar al individuo para tratar una enfermedad está/n especialmente adaptado/s a las características tanto genotípicas como fenotípicas del individuo que va a ser tratado, evitando con ello la pérdida de tiempo en terapias no efectivas. En la presente invención, la característica que determina la terapia que va a ser administrada al individuo es el nivel de expresión del gen PGC-1alfa. Adicionalmente, tal como se explicará más adelante, también pueden medirse otros valores como el potencial de membrana interna mitocondrial, los niveles de las especies reactivas del oxígeno y/o la masa mitocondrial.

En la presente invención, se entiende que el cáncer de pulmón es "resistente a cisplatino" cuando el número de células tumorales (o cancerígenas) no disminuye en

respuesta a la administración de cisplatino como consecuencia de que las células tumorales se han vuelto progresivamente resistentes a este compuesto debido a la administración continuada del mismo al individuo que padece el cáncer de pulmón. Adicionalmente, en la presente invención también se contempla el criterio seguido en la práctica clínica, donde se considera que un individuo presenta un cáncer de pulmón "resistente a cisplatino" cuando el individuo no responde al tratamiento con cisplatino según se establece utilizando los criterios de respuesta al tratamiento de tumoraciones sólidas (Response Evaluation Criteria In Solid Tumors, RECIST), los métodos de medición tridimensional, o ambos. Los criterios RECIST son ampliamente conocidos en el estado de la técnica y son practica de rutina para el experto en la materia.

En la presente invención el término "individuo" es equivalente al término "sujeto", por lo que ambos términos pueden emplearse indistintamente a lo largo de la presente descripción. Se entiende por "individuo", cualquier animal perteneciente a cualquier especie. No obstante, en una realización particular, el sujeto es un mamífero, preferiblemente, un primate, más preferiblemente, un ser humano de cualquier raza, sexo o edad. El individuo objeto de la presente invención padece cáncer de pulmón y va a ser tratado con cisplatino como un primer tratamiento.

El método de la invención comprende en una primera etapa, etapa a), determinar el nivel de expresión del gen PGC-1alfa antes y después del tratamiento con cisplatino en una muestra biológica aislada procedente de dicho individuo.

El gen PGC-1 alfa (PGC-1a) es un gen que, en humanos, está localizado en el cromosoma 4p15.2. Nombres alternativos que pueden usarse en la literatura científica para referirse al gen PGC-1alfa incluyen, pero no se limitan a, "peroxisome proliferative activated receptor, gamma, coactivator 1", "peroxisome proliferative activated receptor, gamma, coactivator 1, alpha", "peroxisome proliferator-activated receptor gamma, coactivator 1 alpha", "PPARG coactivator 1 alpha", PPARGC1A, LEM6, PGC-1v, PGC1 , PGC1A y PPARGC1. En una realización particular, el gen PGC-1alfa comprende una secuencia de nucleótidos con una identidad de secuencia de, al menos, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% con la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 1 (número de acceso a GenBank AF106698 versión AF106698.1). En otra realización particular, el gen PGC-1 alfa comprende una secuencia de nucleótidos con una identidad de secuencia del 100% con la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 1.

En la presente invención se entiende por "identidad de secuencia" al grado de similitud entre dos secuencias de nucleótidos (o aminoácidos) obtenido mediante el alineamiento de las dos secuencias. Dependiendo del número de residuos comunes entre las secuencias alineadas, se obtendrá un grado de identidad expresado en tanto por ciento. El grado de identidad entre dos secuencias de nucleótidos (o aminoácidos) puede determinarse por métodos convencionales, por ejemplo, mediante algoritmos estándar de alineamiento de secuencias conocidos en el estado de la técnica, como por ejemplo BLAST [Altschul S.F. et al. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 1990 Oct 5; 215(3):403-10]. Los programas BLAST, por ejemplo, BLASTN, BLASTX, and TBLASTX, BLASTP and TBLASTN, son de dominio público en la página web de The National Center for Biotechonology Information (NCBI).

El gen PGC-1alfa codifica la proteína PPAR gamma coactivator-1. En una realización particular, la proteína codificada por el gen PGC-1alfa comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de, al menos, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% con la secuencia SEQ ID NO: 2 (número de acceso a GenBank NP_037393 versión NP_037393.1). En otra realización particular, la proteína codificada por el gen PGC-1 alfa comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia del 100% con la secuencia SEQ ID NO: 2. El término "identidad de secuencia" ha sido definido previamente.

El experto en la materia entiende que las mutaciones en la secuencia de nucleótidos de los genes que dan lugar a sustituciones conservativas de aminoácidos en posiciones no críticas para la funcionalidad de la proteína son mutaciones evolutivamente neutras que no afectan a su estructura global ni a su funcionalidad, dando lugar a variantes de la proteína. Dichas variantes caen dentro del ámbito de la presente invención, es decir, aquellas variantes de la proteína codificada por el gen PGC-1alfa que presentan inserciones, deleciones o modificaciones de uno o más aminoácidos con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 2.

En la presente descripción, los términos "expresión" y "expresión génica" incluyen la transcripción y/o traducción del ácido nucleico. Por lo tanto, la cuantificación de la expresión del gen PGC-1alfa puede determinarse a partir del ácido nucleico del gen PGC-1alfa o de la proteína codificada por dicho gen, es decir, de la proteína PPAR gamma coactivator-1.

Así, en una realización particular del método de la invención, la determinación de los niveles de expresión del gen PGC-1alfa comprende medir el nivel de ADNc, o un fragmento del mismo, el nivel de ARNm, o un fragmento del mismo, y/o el nivel de la proteína codificada por dicho gen, o un fragmento de dicha proteína.

En la presente invención se entiende por "fragmento de ARNm" o "fragmento de ADNc" a la secuencia de nucleotidos del gen PGC-1alfa que comprende uno o más nucleotidos ausentes de los extremos 3' y/o 5' con respecto a la secuencia de nucleotidos completa del gen PGC-1alfa. En una realización particular, el fragmento del gen PGC-1alfa es un fragmento de la secuencia SEQ ID NO: 1.

De forma análoga, en la presente invención se entiende por "fragmento de la proteína PPAR gamma coactivator-T a la secuencia de aminoácidos de la proteína PPAR gamma coactivator-1 que comprende uno o más aminoácidos ausentes de su extremo amino terminal o carboxilo terminal con respecto a la secuencia de aminoácidos completa de la proteína PPAR gamma coactivator-1. En una realización particular, el fragmento de la proteína PPAR gamma coactivator-1 es un fragmento de la secuencia SEQ ID NO: 2.

Si la cuantificación de la expresión del gen PGC-1alfa va a realizarse a partir del ADNc o el ARNm, primero es necesaria la extracción del ácido nucleico de la muestra biológica aislada del sujeto. Para este fin, la muestra biológica se puede tratar para disgregar de forma física o mecánica la estructura del tejido o la célula, liberando los componentes intracelulares en una solución acuosa u orgánica para aislar y preparar los ácidos nucleicos. Los ácidos nucleicos se extraen mediante procedimientos conocidos para el experto en la materia y disponibles comercialmente (Sambroock, J., et al. 2012, "Molecular cloning: a Laboratory Manual', 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., Vol. 1-3.).

Una vez extraído el ácido nucleico se procede a realizar la cuantificación de la expresión del gen PGC-1alfa. Prácticamente cualquier método convencional puede ser utilizado dentro del marco de la invención para detectar y cuantificar los niveles de ARNm del gen PGC-1alfa o de su ADNc correspondiente. A modo ilustrativo, no limitativo, los niveles de ARNm de dicho gen pueden ser cuantificados mediante el empleo de métodos convencionales, por ejemplo, métodos que comprenden la amplificación del ARNm y la cuantificación del producto de la amplificación de dicho ARNm, tales como electroforesis y tinción, o alternativamente, mediante Southern blot y empleo de sondas apropiadas, northern blot y empleo de sondas específicas del ARNm del gen de interés (gen PTGDR) o de su ADNc correspondiente, mapeo con la nucleasa S1 , RT-PCR, hibridación, microarrays, etc.

Análogamente, los niveles del ADNc correspondiente a dicho ARNm del gen PGC-1alfa también pueden ser cuantificados mediante el empleo de técnicas convencionales; en este caso, el método de la invención incluye una etapa de síntesis del correspondiente ADNc mediante transcripción inversa (RT) del ARNm correspondiente seguida de amplificación y cuantificación del producto de la amplificación de dicho ADNc. Métodos convencionales de cuantificar los niveles de expresión pueden encontrarse, por ejemplo, en Sambrook et al. citado ad supra. En una realización particular, la cuantificación de los niveles de expresión se realiza mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) cuantitativa, un array de ADN o ARN, o RNA-Seq o Secuenciación Masiva aplicada al estudio de ARN. En otra realización todavía más particular, el nivel de expresión del ARNm del gen PGC-1alfa se determina mediante qRT-PCR usando el ensayo de expresión génica Taqman® (Taqman® gene expression assay) con la sonda Hs01016719_m1.

Si la cuantificación de la expresión del gen PGC-1 alfa va a realizarse a partir de la proteína codificada por el gen PGC-1alfa, es decir, la proteína PPAR gamma coactivator-1 , entonces la muestra biológica aislada del sujeto tiene que ser tratada para extraer las proteínas. Métodos para extraer o aislar proteínas son conocidos para el experto en la materia y están disponibles comercialmente (Sambroock, J., et al. 2012, citado ad supra).

Los niveles de la proteína PPAR gamma coactivator-1 pueden ser cuantificados mediante cualquier método convencional que permita detectar y cuantificar dicha proteína en una muestra de un sujeto. A modo ilustrativo, no limitativo, los niveles de dicha proteína pueden cuantificarse, por ejemplo, mediante el empleo de anticuerpos con capacidad de unirse a la proteína PPAR gamma coactivator-1 y la posterior cuantificación de los complejos formados.

Se entiende por "anticuerpo" a una glicoproteína del tipo gamma globulina que forma parte del sistema inmunitario humoral que se une de forma específica a un antígeno. El término anticuerpo, tal como aquí se utiliza, incluye anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, fragmentos recombinantes de anticuerpos, combibodies, fragmentos Fab y scFv de anticuerpos, así como los dominios de unión a ligando. Anticuerpos específicos de la proteína codificada por el gen PGC-1alfa están disponibles comercialmente. Ejemplos de dichos anticuerpos incluyen, sin limitar a, los anticuerpos 3G6 #2178 de la empresa Cell Signaling, ab54481 de la empresa Abcam y H-300 sc-13067 de la empresa Santa Cruz Biotechnology. Asimismo, los métodos para producir anticuerpos son ampliamente conocidos en el estado de la técnica.

Los anticuerpos que se emplean en estos ensayos pueden estar marcados o no. Los términos "marca" o "marcado" se refieren a una composición capaz de producir una señal detectable indicativa de la presencia de la molécula marcada. Ejemplos ilustrativos de marcadores adecuados incluyen, sin limitar a, radioisótopos, cromóforos de nucleótidos, enzimas, sustratos, moléculas fluorescentes, restos quimioluminiscentes, partículas magnéticas, restos bioluminescentes, y similares. Como tal, una marca es cualquier composición detectable por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, eléctricos, ópticos o químicos. Existe una amplia variedad de ensayos conocidos que se pueden utilizar en la presente invención, que utilizan anticuerpos no marcados (anticuerpo primario) y anticuerpos marcados (anticuerpo secundario); entre estas técnicas se incluyen el Western-blot o transferencia Western, ELISA (enzimoinmunoensayo RIA (radioinmunoensayo), EIA competitivo (enzimoinmunoensayo competitivo), DAS-ELISA (ELISA tipo sándwich con doble anticuerpo), técnicas inmunocitoquímicas e inmunohistoquímicas, técnicas basadas en el empleo de biochips o microarrays de proteínas que incluyan anticuerpos específicos o ensayos basados en precipitación coloidal en formatos tales como dipsticks. Otras maneras para detectar y cuantificar la proteína PPAR gamma coactivator-1 , incluyen técnicas de cromatografía de afinidad, ensayos de unión a ligando, espectrometría de masas etc. No obstante, en una realización particular, la cuantificación de los niveles de proteína se realiza mediante Western blot, ELISA, un array de proteínas o un estudio de binding. Cuando se usa un método inmunológico, se puede usar cualquier anticuerpo o reactivo que se sabe se une a la proteína PPAR gamma coactivator-1 con alta afinidad para detectar la cantidad de la misma. Ejemplos de anticuerpos o reactivos con capacidad de unirse a dicha la proteína PPAR gamma coactivator-1 incluyen, sin limitarse a, sueros policlonales, sobrenadantes de hibridomas o anticuerpos monoclonales, fragmentos de anticuerpos, Fv, Fab, Fab' y F(ab')2, scFv, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y anticuerpos humanizados. En el mercado, existen anticuerpos comerciales contra la

proteína PPAR gamma coactivator-1 que pueden emplearse en el contexto de la presente invención, tales como los citados anteriormente.

Tal como se ha puesto de manifiesto en párrafos anteriores, para llevar a cabo la primera etapa del método de la invención, es necesario disponer de una muestra biológica aislada del individuo en estudio. En el contexto de la presente invención, el término "muestra biológica" se refiere a cualquier material biológico que se puede obtener del individuo, tal como una biopsia, un tejido, una célula o un fluido (suero, saliva, semen, esputo, lágrimas, moco, sudor, leche, extractos de cerebro y similares), y que puede albergar información sobre la dotación genética característica de una persona. En una realización particular, la muestra biológica es sangre, suero o tejido procedente de una biopsia. El término "aislado/a" implica que la muestra biológica ha sido separada o extraída del resto de componentes que la acompañan de forma natural. Técnicas para obtener muestras biológicas de un individuo son ampliamente conocidas en el estado de la técnica, y cualquiera de ellas puede emplearse enla puesta en práctica de la presente invención.

Una vez que se ha llevado a cabo la etapa (a), es decir, se han cuantificado los niveles de expresión del gen PGC-1alfa antes y después del tratamiento con cisplatino, el método de la invención comprende una etapa (b) que comprende comparar entre sí los niveles de expresión obtenidos. Si el nivel de expresión de PGC-1alfa después de tratar al individuo con cisplatino es mayor que el nivel de expresión de PGC-1 alfa antes del tratamiento con cisplatino, entonces la terapia a administrar al individuo comprende la administración de un compuesto dirigido a disminuir la función OXPHOS. En caso contrario, no es necesaria la administración de un compuesto dirigido a disminuir la función OXPHOS.

En la presente invención se entiende que un nivel de expresión es "mayor" que otro cuando un valor del nivel de expresión es superior a otro. En particular, se entiende que un nivel de expresión es "mayor", cuando los niveles de expresión del gen PGC-1alfa después del tratamiento con cisplatino son de, al menos, 1 , 1 veces, 1 ,5 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces o incluso más con respecto a los niveles de expresión del gen PGC-1alfa antes del tratamiento con cisplatino. Dependiendo del resultado de dicha comparación, se puede concluir si la terapia a administrar al individuo comprende la administración de un compuesto dirigido a disminuir la función

OXPHOS.

En la presente invención se entiende por "compuesto dirigido a disminuir la función OXPHOS" al compuesto que disminuye la capacidad de generar energía en forma de ATP por parte del sistema OXPHOS (el sistema de fosforilación oxidativa que a través de una serie de complejos de proteínas que actúan en cadena acaba produciendo moléculas de ATP), ya sea a través de disminuir el aporte de cofactores reducidos, el transporte de electrones, la actividad o cantidad de algunos de sus complejos o disipar el gradiente de protones generado. En una realización particular, el compuesto dirigido a disminuir la función OXPHOS es un inhibidor de la expresión del gen PGC-1alfa, o de la proteína codificada por dicho gen, o es un compuesto que inhibe el complejo I de la cadena transportadora de electrones mitocondrial, preferiblemente, una biguanida o rotenona. Tanto las biguanidas como la rotetona son compuestos que inhiben el complejo I o NADH deshidrogenasa o NADH:ubiquinona oxidoreductasa de la cadena transportadora de electrones mitocondrial.

En la presente invención se entiende por "inhibidor de la expresión del gen PGC-1 alfa" a aquel compuesto capaz de reducir, bloquear o impedir la transcripción y/o la traducción del gen PGC-1 alfa. De forma análoga, se entiende por "inhibidor de la proteína codificada por el gen PGC-1 alfa" a aquel compuesto que es capaz de reducir, bloquear o impedir la actividad o función de la proteína codificada por dicho gen, es decir, la proteína PPAR gamma coactivator-1. Como se ha explicado previamente, la función de PGC-1alfa es actuar como un cofactor transcripcional que favorece la transcripción de diversos genes relacionados con la respuesta antioxidante y la función OXPHOS. Ejemplos de compuestos capaces de inhibir la proteína codificada por el gen PGC-1alfa incluyen, sin limitar a, anticuerpos anti-PPAR gamma coactivator-1 tal como se han descrito en párrafos anteriores. Un ensayo para determinar si un compuesto dado es un inhibidor de la actividad o función de la proteína codificada por el gen PGC-1 alfa es, por ejemplo, y sin excluir otros, la medida de los niveles de expresión de los genes regulados por PGC-1alfa e implicados en la respuesta antioxidante y la función OXPHOS, tales como los genes SOD2, UCP-2, Prx5, TFAM, TOM20, y cualquiera de los 13 mitocondriales, tales como MT-C01 , MT-C02, MT-C03, MT-ND1 , MT-ND2, MT-ND3, MT-ND4, MT-ND4L, MT-ND5, MT-ND6, MT-ATP6, MT-ATP8 y MT-CYTB, entre otros. Métodos para medir los niveles de expresión de un gen han sido explicados en la presente descripción.

En una realización particular, el inhibidor de la expresión del gen PGC-1alfa es un ARN de interferencia. En otra realización todavía más particular, dicho ARN de interferencia comprende la secuencia CCUGUUUGAUGACAGCGAAtt (SEQ ID NO: 3).

En la presente invención se entiende por "compuesto que inhibe el complejo I de la cadena transportadora de electrones mitocondrial" a aquel compuesto que es capaz de bloquear, disminuir, impedir o detener el transporte electrónico mitocrondrial a nivel del complejo I o la NADH deshydrogenasa, de forma que la célula ve mermada o impedida su capacidad de producir ATP. Ejemplos de ensayos útiles para determinar si un compuesto dado es capaz de inhibir el complejo I de la cadena transportadora de electrones incluye, sin limitar a, la medida del potencial de membrana mitocondrial o la producción de ATP.

En la presente invención se entiende por "biguanida" a aquel compuesto clasificado dentro de la categoría A10B del código ATC (Sistema de Clasificación Anatómica, Terapéutica, Química). En otra realización todavía más particular, la biguanida se selecciona del grupo que consiste en fenformina, metformina y buformina. En otra realización aún más particular, el compuesto dirigido a disminuir la función OXPHOS es metformina.

En la presente invención, se entiende por rotenona, a aquel compuesto con actividad insecticida, aislada de las plantas del género Lonchocarpus, que inhibe el transporte electrónico mitocrondrial a nivel del complejo I o la NADH deshydrogenasa. La administración de un compuesto dirigido a disminuir la función OXPHOS puede llevarse a cabo por cualquiera de las formas de administración que existen en el estado de la técnica. Ejemplos de rutas de administración incluyen, sin limitar a, oral, cutánea, parenteral, nasal e intraperitoneal.

Dentro de la presente invención también se contempla la posibilidad de que el compuesto dirigido a disminuir la función OXPHOS se lleve a cabo en combinación con una nueva administración de cisplatino. Por lo tanto, en otra realización particular del método de la invención, la administración del compuesto dirigido a disminuir la función OXPHOS se lleva a cabo en combinación con una nueva administración de cisplatino.

La administración de ambos compuestos (el compuesto dirigido a disminuir la función OXPHOS y cisplatino) puede realizarse al mismo tiempo o de forma separada. Así, en una realización particular del método de la invención, la administración del compuesto dirigido a disminuir la función OXPHOS se lleva a cabo de forma secuencial, simultánea o separada con la nueva administración de cisplatino.

En la presente invención se entiende que la administración es "secuencial" cuando el cisplatino y el compuesto dirigido a disminuir la función OXPHOS son administrados al individuo en diferentes momentos en el tiempo, de forma que primero se administra uno y posteriormente se administra otro. El orden en el que el cisplatino y el compuesto dirigido a disminuir la función OXPHOS son administrados es indiferente.

En la presente invención se entiende que la administración es "simultánea" cuando el cisplatino y el compuesto dirigido a disminuir la función OXPHOS forman parte de la misma composición y son administrados conjuntamente, es decir, al mismo tiempo al individuo.

En la presente invención se entiende que la administración es "separada" cuando el cisplatino y el compuesto dirigido a disminuir la función OXPHOS forman parte de diferentes composiciones, siendo cada una de ellas administrada de forma individual. Como entiende el experto en la materia, la administración "separada" puede ser al mismo "simultánea" si ambas composiciones se administran al mismo tiempo.

Adicionalmente, el método de la invención puede comprender etapas adicionales dirigidas a determinar otros parámetros útiles para diseñar una terapia personalizada a un individuo que padece cáncer de pulmón y que va a ser tratado con cisplatino. Entre dichos parámetros están el potencial interno de membrana mitocondrial (MIMP), los niveles de ROS y/o la masa mitocondrial.

Así, en una realización particular, el método de la invención comprende, además, medir el MIMP antes y después del tratamiento con cisplatino en una muestra biológica aislada procedente de dicho individuo, en donde un MIMP después del tratamiento mayor que el MIMP antes del tratamiento es indicativo de que la terapia después del tratamiento con cisplatino comprende la administración de un compuesto dirigido a disminuir la función OXPHOS. El MIMP puede medirse, por ejemplo, mediante el empleo del colorante DiOC6(3) por citometría de flujo.

En otra realización particular, el método de la invención comprende, además, medir los niveles de ROS antes y después del tratamiento con cisplatino en una muestra biológica aislada procedente de dicho individuo, en donde unos niveles de ROS después del tratamiento mayores que el nivel de ROS antes del tratamiento es indicativo de que la terapia después del tratamiento con cisplatino comprende la administración de un compuesto dirigido a disminuir la función OXPHOS. Los niveles de ROS pueden medirse, por ejemplo, mediante la determinación de la actividad catalasa o la cuantificación de malondialdehido, entre otros.

En otra realización particular, el método de la invención comprende, además, medir la masa mitocondrial antes y después del tratamiento con cisplatino en una muestra biológica aislada procedente de dicho individuo, en donde una masa mitocondrial después del tratamiento mayor que la masa mitocondrial antes del tratamiento es indicativo de que la terapia después del tratamiento con cisplatino comprende la administración de un compuesto dirigido a disminuir la función OXPHOS.

Los reactivos, condiciones y métodos para medir el MIMP, los niveles de ROS y la masa mitocondrial son ampliamente conocidos en el estado de técnica.

A la vista de lo explicado anteriormente, dentro de la presente invención también se contempla el empleo de los niveles de expresión del gen PGC-1alfa para diseñar una terapia personalizada a un individuo que padece un cáncer de pulmón resistente a cisplatino.

Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invención se relaciona con el uso in vitro del nivel de expresión del gen PGC-1 alfa para diseñar una terapia personalizada a un individuo que padece un cáncer de pulmón resistente cisplatino. De aquí en adelante, a este aspecto inventivo se le denominará "uso de la invención". Cómo usar el nivel de expresión del gen PGC-1alfa para diseñar dicha terapia personalizada, ha sido explicado en párrafos anteriores. Así, en una realización particular, cuando el nivel de expresión de PGC-1alfa después del tratamiento con cisplatino es mayor que el nivel de expresión de PGC-1alfa antes de dicho tratamiento, entonces la terapia después del tratamiento con cisplatino comprende la administración de un compuesto dirigido a disminuir la función OXPHOS.

Los términos empleados en el presente aspecto inventivo, tales como nivel de expresión, gen PGC-1 alfa, terapia personalizada, etc. han sido explicados en párrafos anteriores y son aplicables al presente aspecto inventivo.

Asimismo, las realizaciones particulares que han sido descritas para el método de la invención, también son aplicables al uso de la invención.

En una realización particular, el uso de la invención comprende, además, el uso del MIMP, de los niveles de ROS, y/o de la masa mitocondrial para diseñar una terapia personalizada a un individuo que padece un cáncer de pulmón resistente a cisplatino. Así, en otra realización particular, un MIMP, unos niveles de ROS y/o una masa mitocondiral después del tratamiento con cisplatino mayores que el MIMP, los niveles de ROS y/o la masa mitocondrial antes de dicho tratamiento, son indicativos de que la terapia después del tratamiento con cisplatino comprende un compuesto dirigido a disminuir la función OXPHOS. Todos estos términos y expresiones han sido explicados en el anterior aspecto de la invención.

En una realización particular, el compuesto dirigido a disminuir la función OXPHOS es un inhibidor de la expresión del gen PGC-1alfa, o de la proteína codificada por dicho gen, o es un compuesto que inhibe el complejo I de la cadena transportadora de electrones mitocondrial, preferiblemente, una biguanida o rotenona. En otra realización más particular, el inhibidor de la expresión de gel PGC-1alfa es una ARN de interferencia, que en otra realización todavía más particular, comprende la secuencia SEQ ID NO: 3. En otra realización más particular, la biguanida se selecciona del grupo que consiste en fenformina, metformina y buformina.

En una realización particular del uso de la invención, la administración del compuesto dirigido a disminuir la función OXPHOS se lleva a cabo en combinación con una nueva administración de cisplatino. Tal como se ha explicado previamente, esta nueva administración del cisplatino puede llevarse a cabo de manera secuencial, simultánea o separada.

Así, en otra realización particular, la nueva administración de cisplatino en combinación con el compuesto dirigido a disminuir la función OXPHOS se lleva a cabo de forma secuencial, simultánea o separada. Los términos "secuencial", "simultánea" o "separada" han sido definidos previamente en la presente descripción.

En el contexto de la presente invención, los niveles de expresión del gen PGC-1 alfa pueden usarse para diseñar una terapia a un individuo que padece cualquier tipo de cáncer de pulmón resistente a cisplatino. No obstante, en una realización particular, el cáncer de pulmón es metastásico. En otra realización particular, el cáncer de pulmón es NSCLC. En otra realización todavía más particular del uso de la invención, el cáncer de pulmón es NSCLC metastásico.

En la presente invención, pueden usarse cualquiera de las moléculas representativas de los niveles de expresión del gen PGC-1 alfa, tales como el ADNc, el ARNm y/o la proteína codificada por dicho gen. Todas estas moléculas, así como explicaciones sobre el uso de ellas para determinar el nivel de expresión del gen PGC-1alfa, han sido descritas en párrafos anteriores de la presente descripción. Así, en una realización particular el uso de la invención, el nivel de expresión del gen PGC-1 alfa comprende determinar el nivel de ADNc, ARNm y/o la proteína codificada por dicho gen.

Adicionalmente, dentro de los aspectos inventivos incluidos dentro de la presente invención, se contempla el uso de un compuesto dirigido a disminuir la función OXPHOS en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de cáncer de pulmón resistente a cisplatino en un individuo.

Así, en otro aspecto, la presente invención se relaciona con el uso de un compuesto dirigido a disminuir la función OXPHOS en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de cáncer de pulmón resistente a cisplatino en un individuo, en donde dicho individuo comprende un nivel de expresión del gen PGC-1alfa después del tratamiento con cisplatino mayor que el nivel de expresión del gen PGC-1alfa antes del tratamiento.

Análogamente, la presente invención también se relaciona con un compuesto dirigido a disminuir la función OXPHOS para usarse en el tratamiento de cáncer de pulmón resistente a cisplatino en un individuo, en donde dicho individuo comprende un nivel de expresión del gen PGC-1 alfa después del tratamiento con cisplatino mayor que el nivel de expresión del gen PGC-1alfa antes del tratamiento.

Igualmente, en la invención también se contempla un método para el tratamiento de cáncer de pulmón resistente a cisplatino en un individuo que comprende la

administración a dicho individuo de un compuesto dirigido a disminuir la función OXPHOS, en donde dicho individuo comprende un nivel de expresión del gen PGC-1alfa después del tratamiento con cisplatino mayor que el nivel de expresión del gen PGC-1alfa antes del tratamiento.

Realizaciones particulares del presente aspecto inventivo comprenden:

- el compuesto dirigido a disminuir la función OXPHOS se emplea en combinación con cisplatino en la elaboración del medicamento.

- el individuo comprende, además, un MIMP después del tratamiento con cisplatino mayor que el MIMP antes del tratamiento, unos niveles de ROS después del tratamiento con cisplatino mayores que los niveles de ROS antes del tratamiento, y/o una masa mitocondrial después del tratamiento con cisplatino mayor que la masa mitocondrial antes del tratamiento con cisplatino;

- El cáncer de pulmón es NSCLC y/o metastásico;

- El nivel de expresión del gen PGC-1alfa corresponde al nivel de ADNc, ARNm y/o la proteína codificada por dicho gen;

- El compuesto dirigido a disminuir la función OXPHOS es un inhibidor de la expresión del gen PGC-1alfa, o de la proteína codificada por dicho gen, o es un compuesto que inhibe el complejo I de la cadena transportadora de electrones mitocondrial, preferiblemente, una biguanida o rotenona. En otra realización particular, el inhibidor de la expresión del gen PGC-1 alfa es un ARN de interferencia. En otra realización más particular, la biguanida se selecciona del grupo que consiste en fenformina, metformina y buformina.

Todas estas realizaciones particulares así como las expresiones y términos empleados han sido descritos en párrafos anteriores, y son aplicables al presente aspecto inventivo.

Técnicas y materiales para elaborar medicamentos (excipientes, vehículos, formas galénicas, formulaciones, etc.) son ampliamente conocidas en estado de la técnica y su aplicación es práctica de rutina para el experto en la materia. Los términos "medicamento" y "composición farmacéutica" son equivalentes y pueden usarse indistintamente en el contexto de la presente invención.

Para poner en práctica la presente invención es necesario disponer de un kit que comprende los reactivos necesarios para determinar los niveles de expresión del gen PGC-1alfa. Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invención se relaciona con un kit para diseñar una terapia personalizada a un individuo que padece cáncer de pulmón y que va a ser tratado con cisplatino, de aquí en adelante "kit de la invención", que comprende los reactivos necesarios para determinar los niveles de expresión del gen PGC-1alfa.

En el contexto de la presente invención, se entiende por kit al producto que contiene los reactivos necesarios para llevar a cabo el método de la invención adaptado para permitir su transporte y almacenamiento. Los materiales adecuados para el embalaje de los componentes del kit incluyen, sin limitar a, polietileno, polipropileno, policarbonato y similares, de cristal, de plástico, etc. El kit también puede comprender botellas, frascos, papel, sobres, etc.

La expresión "reactivo que permite determinar el nivel de expresión de un gen" significa un compuesto o un grupo de compuestos que permite determinar el nivel de expresión de un gen, tanto por medio de la determinación del nivel de ADNc o ARNm como por medio del nivel de proteína. Por lo tanto, los reactivos del primer tipo incluyen ácidos nucleicos, e.g. cebadores y sondas, capaces de hibridar específicamente con el ARNm codificado por el gen involucrado. Los reactivos del segundo tipo son compuestos que se unen específicamente a la proteína codificada por el gen y, preferentemente, se incluyen los anticuerpos aunque pueden ser aptámeros específicos.

Así, en una realización particular, los reactivos necesarios para determinar los niveles de expresión del gen PGC-1alfa comprenden

-un ácido nucleico que híbrida de forma específica con el gen PGC-1alfa, o con un fragmento del mismo, y/o

- anticuerpos que reconocen de forma específica la proteína codificada por el gen PGC-1alfa, o un fragmento de la misma.

Ejemplo de un ácido nucleico que híbrida de forma específica con el gen PGC-1 alfa es, por ejemplo, una sonda. En la presente invención se entiende por "sonda" a la molécula de ácido nucleico cuya secuencia de nucleótidos híbrida de forma específica con la secuencia de nucleótidos de un gen diana. En la presente invención, el gen diana es el gen PGC-1alfa. La expresión "híbrida de forma específica", tal como se usa aquí, se refiere a las condiciones que permiten la hibridación de dos polinucleótidos en condicionales altamente o moderadamente rigurosas. Condiciones de alta rigurosidad implican, en general: (1) fuerza iónica baja y alta temperatura para el lavado, por ejemplo de cloruro de sodio 0,015M/citrato de sodio 0,0015M/0, 1 % dodecil sulfato de sodio a 50°C, (2) empleo durante la hibridación de un agente de desnaturalización, tales como formamida, por ejemplo, el 50% (v/v) formamida con 0,1 % de albúmina de suero bovino/0,1 % Ficoll/0, 1 % polivinilpirrolidone/tampón fosfato de sodio 50 mM a pH 6,5 con cloruro de sodio a 750 mM, 75 mM de citrato de sodio a 42°C, o (3) empleo de 50% de formamida, 5xSSC (0,75 M NaCI, 0,075 M citrato de sodio), fosfato sódico 50mM (pH 6,8), 0, 1 % de pirofosfato de sodio, 5 veces solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50 mg/mL), 0, 1 % SDS, y el 10% de sulfato de dextrano a 42°C, con lavados a 42°C en 0,2xSSC (cloruro sódico/citrato de sodio) y el 50% de formamida, seguido de un lavado de alto rigor que consiste en 0,1xSSC que contiene EDTA a 55°C. "Condiciones moderadamente rigurosas" incluyen el uso de solución de lavado y las condiciones de hibridación menos estrictas que las descritas anteriormente. Como llevar a cabo la hibridación de dos secuencias de nucleótidos puede encontrarse en Sambroock, J., et al. 2012, citado ad supra.

En el caso de que los niveles de expresión del gen PGC-1 alfa se determinen mediante la medición de los niveles de proteína codificada por dicho gen, el kit de la invención comprende reactivos que son capaces de unirse específicamente a dicha proteína, tales como los anticuerpos. Ejemplos de anticuerpos que pueden reconocer de forma específica la proteína codificada por el gen PGC-1 alfa y unirse a ella han sido descritos en párrafos anteriores.

En otra realización particular, el gen PGC-1alfa comprende una secuencia de nucleótidos con una identidad de secuencia de, al menos, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99% con la secuencia SEQ ID NO: 1. En otra realización particular, el gen PGC-1alfa comprende una secuencia de nucleótidos con una identidad de secuencia del 100% con la secuencia SEQ ID NO: 1.

Adicionalmente, el kit de la invención puede comprender reactivos dirigidos a determinar otros parámetros útiles para diseñar una terapia personalizada a un individuo que padece cáncer de pulmón resistente a cisplatino. Como se ha indicado anteriormente, entre dichos parámetros están el MIMP, los niveles de ROS y/o la masa mitocondrial. Así, en una realización particular, el kit comprende además reactivos para medir el MIMP, los niveles de ROS y/o la masa mitocondrial.

En otro aspecto, la invención se dirige a el uso in vitro del kit de la invención para diseñar una terapia personalizada a un individuo que padece cáncer de pulmón resistente a cisplatino, en donde dicho individuo comprende un nivel de expresión del gen PGC-1 alfa después del tratamiento con cisplatino mayor que el nivel de expresión del gen PGC-1alfa antes del tratamiento.

Como se ha indicado anteriormente, a la hora de diseñar la terapia personalizada al individuo, pueden tenerse en cuenta otro tipo de parámetros. Así, en una realización particular, el individuo comprende, además, un MIMP después del tratamiento con cisplatino mayor que el MIMP antes del tratamiento, unos niveles de ROS después del tratamiento con cisplatino mayores que los niveles de ROS antes del tratamiento, y/o una masa mitocondrial después del tratamiento con cisplatino mayor que la masa mitocondrial antes del tratamiento con cisplatino.

En otra realización particular, el cáncer de pulmón es metastásico y/o el cáncer de pulmón es cáncer de pulmón de células no pequeñas.

En otro aspecto, la presente invención se relaciona con el uso de un kit que comprende un compuesto dirigido a disminuir la función OXPHOS en el tratamiento del cáncer de pulmón resistente a cisplatino en un individuo, donde dicho individuo comprende unos niveles de expresión del gen PGC-1 alfa después del tratamiento con cisplatino mayores que los niveles de expresión del gen PGC-1alfa antes del tratamiento. En una realización particular del kit, el compuesto dirigido a disminuir la función OXPHOS es un inhibidor de la expresión del gen PGC-1alfa, o de la proteína codificada por dicho gen, o es un compuesto que inhibe el complejo I de la cadena transportadora de electrones mitocondrial, preferiblemente, una biguanida o rotenona. En otra realización más particular, la biguanida se selecciona del grupo que consiste en fenformina, metformina y buformina. En otra realización particular, el inhibidor de la expresión del gen PGC-1alfa es un ARN de interferencia. Otros parámetros que el individuo puede presentar aumentados después del tratamiento con cisplatino en comparación con dicho parámetros antes del tratamiento con cisplatino son el MIMP, los niveles de ROS y/o la masa mitocondrial.

Por otro lado, dentro de la presente invención también se contemplan los siguientes aspectos inventivos junto con sus realizaciones particulares:

En un aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro para diseñar una terapia personalizada a un individuo que padece cáncer de pulmón y que va a ser tratado con cisplatino que comprende

(a) determinar el nivel de expresión del gen PGC-1alfa antes y después del tratamiento con cisplatino en una muestra biológica aislada procedente de dicho individuo, y

(b) comparar el nivel de expresión obtenido en la etapa (a) antes del tratamiento con el nivel de expresión después del tratamiento,

en donde un nivel de expresión de PGC-1alfa después del tratamiento mayor que el nivel de expresión de PGC-1 alfa antes del tratamiento es indicativo de que la terapia comprende una segunda administración de cisplatino en combinación con un compuesto dirigido a disminuir la función OXPHOS.

En una realización particular, el método comprende, además, medir el potencial interno de membrana mitocondrial (MIMP) antes y después del tratamiento con cisplatino en una muestra biológica aislada procedente de dicho individuo, en donde un MIMP después del tratamiento mayor que el MIMP antes del tratamiento es indicativo de que la terapia comprende una segunda administración de cisplatino en combinación con un compuesto dirigido a disminuir la función OXPHOS.

En otra realización particular, el método comprende, además, medir los niveles de radicales libres de oxígeno (ROS) antes y después del tratamiento con cisplatino en una muestra biológica aislada procedente de dicho individuo, en donde unos niveles de ROS después del tratamiento mayores que el nivel de ROS antes del tratamiento es indicativo de que la terapia comprende una segunda administración de cisplatino en combinación con un compuesto dirigido a disminuir la función OXPHOS.

En otra realización particular, el cáncer de pulmón del método es metastásico y/o cáncer de pulmón de celular no pequeñas (NSCLC). Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el cáncer de pulmón es metastásico.

En otra realización particular, la medida o cuantificación de los niveles de expresión del gen PGC-1alfa comprende medir el nivel de ADNc, ARNm y/o la proteína codificada por dicho gen.

En otra realización particular, la muestra biológica es sangre, suero o tejido procedente de una biopsia.

En otra realización particular, la administración de cisplatino en combinación con el compuesto dirigido a disminuir la función OXPHOS se lleva a cabo de forma secuencial, simultánea o separada.

En otra realización particular, el compuesto dirigido a disminuir la función OXPHOS es una biguanida, preferiblemente, la biguanida se selecciona del grupo que consiste en fenformina, metformina y buformina.

En el contexto del presente aspecto inventivo, también se incluyen combinaciones de las realizaciones particulares aquí descritas, así como la presencia simultánea de todas las realizaciones particulares en el método descrito.

En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso in vitro del nivel de expresión del gen PGC-1alfa para diseñar una terapia personalizada a un individuo que padece un cáncer de pulmón y que va a ser tratado con cisplatino.

En una realización particular, adicionalmente a los niveles de expresión del gen PGC-1alfa, también se contempla el uso del MIMP y/o de los niveles de ROS para diseñar una terapia personalizada a un individuo que padece un cáncer de pulmón y que va a ser tratado con cisplatino.

En otra realización particular, un nivel de expresión de PGC-1alfa después del tratamiento con cisplatino mayores que el nivel de expresión de PGC-1alfa antes de dicho tratamiento, es indicativo de que la terapia comprende una segunda administración de cisplatino en combinación con un compuesto dirigido a disminuir la función OXPHOS.

En otra realización particular, un MIMP y/o unos niveles de ROS después del tratamiento con cisplatino mayores que el MIMP y/o los niveles de ROS antes de dicho tratamiento, es indicativo de que la terapia comprende una segunda administración de cisplatino en combinación con un compuesto dirigido a disminuir la función OXPHOS.

En otra realización particular, el compuesto dirigido a disminuir la función OXPHOS es una biguanida, preferiblemente, la biguanida se selecciona del grupo que consiste en fenformina, metformina y buformina.

En otra realización particular, la administración de cisplatino en combinación con el compuesto dirigido a disminuir la función OXPHOS se lleva a cabo de forma secuencial, simultánea o separada.

En otra realización particular, el cáncer de pulmón es metastásico y/o cáncer de pulmón de células no pequeñas.

En otra realización particular, el nivel de expresión del gen PGC-1alfa comprende determinar el nivel de ADNc, ARNm y/o la proteína codificada por dicho gen.

En el contexto del presente aspecto inventivo, también se incluyen combinaciones de las realizaciones particulares aquí descritas, así como la presencia simultánea de todas las realizaciones particulares.

En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de cisplatino combinado de forma secuencial, simultánea o separada con compuesto dirigido a disminuir la función OXPHOS en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de cáncer de pulmón en un individuo va a ser tratado con cisplatino, en donde dicho individuo comprende un nivel de expresión de PGC-1alfa después del tratamiento mayor que el nivel de expresión de PGC-1 alfa antes del tratamiento.

En una realización particular, el individuo comprende, además, un MIMP después del tratamiento mayor que el MIMP antes del tratamiento y/o unos niveles de ROS después del tratamiento, mayores que los niveles de ROS antes del tratamiento.

En otra realización particular, el cáncer de pulmón es metastásico y/o cáncer de pulmón de células no pequeñas.

En otra realización particular, el nivel de expresión del gen PGC-1alfa corresponde al nivel de ADNc, ARNm y/o la proteína codificada por dicho gen.

En otra realización particular, el compuesto dirigido a disminuir la función OXPHOS es una biguanida, preferiblemente, la biguanida se selecciona del grupo que consiste en fenformina, metformina y buformina.

En el contexto del presente aspecto inventivo, también se incluyen combinaciones de las realizaciones particulares aquí descritas, así como la presencia simultánea de todas las realizaciones particulares.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un kit para diseñar una terapia personalizada a un individuo que padece cáncer de pulmón y que va a ser tratado con cisplatino que comprende los reactivos necesarios para determinar los niveles de expresión del gen PGC-1alfa.

En una realización particular, los reactivos del kit comprenden

- un ácido nucleico que híbrida de forma específica el gen PGC-1 alfa, y/o

- anticuerpos que reconocen de forma específica la proteína codificada por el gen PGC-1alfa.

En otra realización particular, el gen PGC-1alfa comprende una secuencia de nucleótidos con una identidad de secuencia de, al menos, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99% con la secuencia SEQ ID NO: 1.

En otra realización particular, el kit comprende además reactivos para medir el MIMP y/o los niveles de ROS.

En el contexto del presente aspecto inventivo, también se incluyen combinaciones de las realizaciones particulares aquí descritas, así como la presencia simultánea de todas las realizaciones particulares.

En otro aspecto, la presente invención se relaciona con el uso in vitro de un kit según se ha descrito en párrafos anteriores, para diseñar una terapia personalizada a un individuo que padece cáncer de pulmón y que va a ser tratado con cisplatino.

Todas estas realizaciones particulares así como las expresiones y términos empleados han sido descritos en párrafos anteriores, y son aplicables a los presentes aspectos inventivos.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1 : Generación de las líneas resistentes a CDDP (cisplatino). Tras el tratamiento continuado de las líneas celulares A549 (A), H1299 (B) y H460 (C) con 5 μΜ CDDP, se obtuvieron versiones resistentes. Los gráficos representan el porcentaje de células viables (Eje-Y) tras 48 horas de diferentes tratamientos con CDDP (Eje-X). Caracterización del ciclo celular de las líneas parentales y resistentes a CDDP (D, E y F). No se observaron diferencias significativas entre las líneas celulares en el porcentaje de células en las fases G1 , S y G2 del ciclo celular. Los datos son la media de al menos tres experimentos diferentes y están representados como porcentaje relativo a las células sin tratar. Las barras de error indican la desviación estándar. El valor p de la prueba t de Student se consideró estadísticamente significativo cuando fue menor de 0,05 (*=P≤0,05, **=P≤0,01 , ***=P≤0,001).

Figura 2: Reprogramación metabólica en líneas resistentes a CDDP. (A) Consumo de glucosa de las líneas celulares. (B) Relación entre la tasa de crecimiento en galactosa y glucosa de las líneas celulares parentales y resistentes a CDDP, un aumento de esta relación es indicativo de un aumento de la función OXPHOS. El potencial de membrana interna mitocondrial (C) y los niveles de ROS totales (D) fueron medidos por citometría de flujo con las sondas fluorescentes TMRE y DCFHDA respectivamente. (E) Supercomplejos OXPHOS en las líneas H1299 y H460. (F y G) Masa mitocondrial medida mediante Mitotracker Green (MTG) y TOM20 inmunofluorescencia. (H) Niveles relativos de ARNm para el gen PGC-1a comparado con las líneas parentales. Las barras de error indican la desviación estándar. Los datos son medias de, al menos, tres diferentes experimentos y están representados de forma relativa a su línea parental. El valor p de la prueba t de Student se consideró estadísticamente significativo cuando fue menor de 0,05 (*=P≤0,05, **=P≤0,01 , ***=p ≤0,001).

Figura 3: Aumento de PGC-1a y masa mitocondrial en modelos de PDX después del tratamiento con CDDP. (A) Niveles de ARNm de PGC-1 a en relación con los controles no tratados para los tumores obtenidos a partir de los modelos PDX6 y PDX8. (B) Evaluación de masa mitocondrial por IHC para TOM20 y cuantificación de fluorescencia en controles y muestras tratadas con CDDP para los mismos PDX.

Figura 4: Resistencia a Cisplatino aumenta la sensibilidad a PGC-1 a siRNA, Metformina y Rotenona. (A) Niveles de PGC-1 a tras el silenciamiento génico con un siRNA inespecífico (control) o especifico a la secuencia del gen PGC-1a. (B) La interferencia de PGC-1 a disminuye la masa mitocondrial medida con MTG. (C) Sensibilidad a la interferencia de PGC-1 a en A549 y H1299. (D) El tratamiento con metformina reduce el MIMP tanto en las líneas parentales como resistentes. (E y F) Sensibilidad a metformina y rotenona para las líneas A549 y H1299 parentales y resistentes. Los gráficos representan el porcentaje de células viables (Eje- Y) tras 48 horas de diferentes tratamientos con CDDP (Eje-X). Los datos son la media de al menos tres experimentos diferentes y están representados como porcentaje relativo a las células sin tratar. Las barras de error indican la desviación estándar. El valor p de la prueba t de Student se consideró estadísticamente significativo cuando fue menor de 0,05 (*=P≤0,05, **=P≤0,01 , ***=P≤0,001).

Figura 5: Cambios en la respuesta temprana al tratamiento con CDDP. Las líneas celulares resistentes a CDDP y parentales se trataron con 5 μΜ de CDDP durante 24 horas. Se evaluaron los cambios en ROS (A), niveles de PGC1-a (B), masa mitocondrial (C) y MIMP (D). El tratamiento simultaneo con NAC 10 mM es capaz de evitar el aumento de ROS y MIMP inducidos por el tratamiento con CDDP a las 24 horas (E). Análisis del ciclo celular y MIMP durante el tratamiento con CDDP (F).

Figura 6: El tratamiento con ZLN005 induce un aumento en la masa mitocondrial y reduce la sensibilidad a CDDP en las líneas celulares. (A) Masa mitocondrial medida por MTG y TOM20 IHC en células tratadas con ZLN005 durante 48 horas. Las barras son medias de al menos tres experimentos diferentes y se representan como porcentaje relativo a células sin tratamiento. (B) ZLN005 reduce la sensibilidad al CDDP disminuyendo la apoptosis. Panel izquierdo, porcentaje de células viables después de 48 h de tratamientos. Panel derecho, las barras del gráfico representan el porcentaje medio de células positivas a anexina. Las barras de error indican la desviación estándar. El valor p de la prueba t de Student se consideró estadísticamente significativo cuando fue menor de 0,05 (*=P≤0,05, **=P≤0,01 , ***=p ≤0,001).

Figura 7: Inhibición metabólica en concomitancia con CDDP en células parentales y resistentes a CDDP. La interferencia de PGC-1a reduce el aumento de MTG producido por CDDP (A). Efecto del tratamiento combinado del siRNA frente a PGC-1a y CDDP sobre la viabilidad celular (B). El tratamiento con metformina reduce el aumento de MIMP producido por el tratamiento con CDDP (C). La metformina y la rotenona eliminan las diferencias entre las líneas celulares parentales y resistentes al tratamiento con cisplatino para las células A549 y H1299 (D y E). Los gráficos representan el porcentaje de células viables (eje Y) después de 48 horas de diferentes tratamientos con Metformina o Rotenona (eje X). Los datos son la media de, al menos, tres experimentos diferentes y están representados como porcentaje relativo a las células sin tratar. Las barras de error indican la desviación estándar. El valor p de la prueba t de Student se consideró estadísticamente significativo cuando fue menor de 0,05 (*=P≤0,05, **=P≤0,01 , ***=P≤0,001).

EJEMPLOS

A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la efectividad del producto de la invención.

I. MATERIAL y MÉTODOS

1.1 Lineas celulares y reactivos.

Las líneas celulares A549 (ATCC® CCL-185™), H1299 (ATCC® CRL-5803™), y H460 (ATCC® HTB-177™) fueron obtenidas a partir de la ATCC. La línea A549 proviene de un tumor primario de cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP o en inglés NSCLC), mientras que las líneas H1299 y H460 provienen de metástasis de CPCNP, más concretamente, las células H1299 están derivadas de ganglio linfático y las H460 de una efusión pleural. Todas las células se cultivaron de forma rutinaria en DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's médium) suplementado con 10% de suero fetal bovino,

penicilina y streptomicina. El cisplatino se obtuvo de excedentes terapéuticos del servicio de Oncología Médica del Hospital Puerta de Hierro Majadahonda. La metformina se obtuvo de sigma.

1.2 Pacientes:

Todos los experimentos llevados a cabo en este estudio cumplieron con las leyes vigentes de España y la Unión Europea y los principios de la Declaración de Helsinki. El estudio y los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de Ética del Hospital Universitario Puerta de Hierro y se obtuvo el consentimiento informado por escrito para todos los pacientes reclutados.

1.3 Ensayos de viabilidad celular.

3x103 células se sembraron en una placa multipocillo de 96 y fueron cultivados en DMEM hasta el día siguiente. A la mañana siguiente el medio fue sustituido por DMEM que contenía los diferentes tratamientos de acuerdo a las leyendas de las figuras. La viabilidad celular se determinó mediante el kit comercial Cell counting Kit-8 (CCK-8) (Dojindo EU GmBH, Munich, Germany) siguiendo las instrucciones del fabricante.

1.4 Curvas de crecimiento en glucosa y galactosa:

El crecimiento celular se evaluó después de sembrar 25.000 células/pocilio y cultivar las células durante 4 días en DMEM que contenía 4,5 g/L de glucosa o 0,9 g/L de galactosa. Las células se recogieron y contaron cada 24 horas. Los tiempos de duplicación se calcularon utilizando el software Doubling Time v1.0.10 (http://www.doubling-time.com). Los ensayos se realizaron por duplicado en al menos 3 experimentos independientes.

1.5 Citometría de Flujo.

Los ROS citoplasmáticos fueron determinados utilizando 2',7'-Diclorofluoresceina diacetato (H2DCFHDA). El potencial interno mitocondrial MIMP fue determinado utilizando Tetrametilrodamina etil ester (TMRE). El ciclo celular fue determinado mediante el uso de Vybrant™ DyeCycle™ Violet Stain. La masa mitocondrial fue determinada utilizando Mitotracker Green FM. Todas las sondas fluorescentes fueron adquiridas de Thermo Scientific.

Para estos ensayos, se cultivaron 1x105 células. Tras la adición de los fluoróforos, (5μΜ Vybrant, 30μΜ DCFHDA, 100nM TMRE, 100nM MTG) y su incubación durante

30 minutos a 37°C en la oscuridad, las células fueron recuperadas en DMEM y analizadas inmediatamente en un citómetro Cytomic FC500 MPL (BeckmanCoulter). El tamaño y complejidad fueron utilizados para determinar la población viable de las células, y la intensidad media de la fluorescencia se determinó con el software MXP (BeckmanCoulter). Los experimentos se realizaron por duplicado en al menos tres pases independientes.

1.6 Consumo de glucosa:

El consumo de glucosa se determinó midiendo la concentración presente en el medio celular a lo largo del tiempo. Para hacer esto, se sembraron 3x105 células en una placa de 6 pocilios. Al día siguiente, se retiró el medio y se añadieron 500μΙ_ de DMEM fresco. Después de 6 horas de incubación, se determinó la concentración presente en el medio. Para medir la concentración de glucosa en el medio, se calibró y usó un glucometro Accu-Check Performa (Roche). Tanto las muestras como la curva estándar (500-0,15 g/L) se diluyeron ½ con agua destilada antes de la medición. Los resultados se muestran como miligramos de glucosa consumida a las 6 horas. Se obtuvieron al menos tres mediciones independientes para generar la media.

1.7 Consumo de oxígeno:

El consumo de oxígeno de las células intactas se midió en DMEM a 37°C usando un electrodo de oxígeno de tipo Clark (Hansatech Instruments). La respiración basal se calculó como la tasa de consumo de oxígeno menos la respiración no mitocondrial después de la adición de 1 mM KCN. Se obtuvieron al menos tres mediciones independientes para generar la media.

1.8 OXPHOS Blue Native PAGE:

Las mitocondrias se purificaron a partir de cultivos celulares como se describe en Pello et al., 2008 (Hum. Mol. Genet. 17: 4001-401 1). Las concentraciones de proteína se determinaron usando el kit de proteína microBCA (Thermo Scientific). Para obtener proteínas mitocondriales nativas, los sedimentos se solubilizaron con 4 gramos de digitonina (Sigma) por gramo de proteína en 1 ,5M de ácido aminocaproico, 50 mM de Bis-Tris, pH 7,0. La electroforesis nativa se realizó tal como se describe en Wittig et al., 2006. NDUFA9 (Abcam, ab14713) se usó para la inmunodeteccion de supercomplejos I+II I2+IV. SDHA (Abcam, ab14715) se usó para la normalización. La cuantificación de 4 membranas diferentes de 2 extractos diferentes se realizó con ImageJ.

1.9 Inmunofluorescencia:

Las células se fijaron con paraformaldehído al 4%, se incubaron durante la noche con anticuerpo TOM20 (Santa Cruz Biotechnology, sc-17764, 1/50). Alexa Fluor 488 antiratón (Invitrogen Life Technologies, 1/500) se utilizó como anticuerpo secundario. Los núcleos se tiñeron con Topro-3 (Invitrogen Life Technologies, 1/1000). Se recogieron cinco imágenes de cada muestra con un microscopio confocal TCS SP5 (Leica Microsystems) equipado con 20 χ HCX PL APO (0,7 apertura numérica). Se adquirieron dos canales secuencialmente con los siguientes parámetros de excitación y emisión: (488 nm, 500-540 nm) para la señal TOM20, y (633 nm, 645-750 nm) para Topro-3. El procesamiento de datos y la cuantificación de la señal de fluorescencia se realizaron con LASF SOFTWARE VERSIÓN 2.6.07266.

1. 10 Análisis de expresión.

El ARN de las células se extrajo utilizando el kit "RNeasy mini Kit with DNAse" (Qiagen) y el ADNc se sintetizó utilizando el kit "NZY First-StrandcDNASynthesis Kit" (NZYtech). Los niveles de expresión de PGC-1 a se evaluaron mediante qRT-PCR utilizando el ensayo de expresión Taqman® (Hs01016719_m1). Los niveles de TBP (Hs00427621_m1) se utilizaron como control endógeno.

1. 11 Modelos de xenoinjerto derivado de pacientes CPCNP (PDX):

Se generaron cuatro modelos diferentes de PDX de cuatro pacientes con CPCNP. Todos los tratamientos se llevaron a cabo en ratones de pase 2, con tumores bilaterales palpables. Al menos dos ratones por grupo fueron inyectados intraperitonealmente con 2,5 mg/kg de CDDP o vehículo dos veces por semana en días no consecutivos. Después de los tratamientos, los animales fueron sacrificados y los tumores fueron recolectados para su posterior análisis.

1. 12 Silenciamiento de PGC-1ct mediante siRNA:

Las células se transfectaron 24 horas antes de los experimentos funcionales mediante Silencer Select™ siRNA dirigido a PGC-1a (s21394, secuencia 5'->3': CCUGUUUGAUGACAGCGAAtt (SEQ ID NO: 3)) o utilizando un control no especifico (Silencer™ Select Negative Control No. 1) usando Lipofectamine RNAiMAX siguiedo las instrucciones del fabricante (Thermo Scientific).

1.13 Medida de apoptosis

Las células se sembraron en una placa de 24 pocilios en DMEM. Al día siguiente, los medios se cambiaron a DMEM o DMEM que contenía los diferentes tratamientos (5μΜ CDDP y/o 20μΜ ZLN005). Después de 48 horas de tratamiento, las células se recogieron, se lavaron dos veces en PBS y se resuspendieron en 50μΙ de solución de unión de anexina V diluida 10 veces. Se añadió 1 μΙ_ de conjugado de anexina V-FITC a las células y se incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente. Finalmente, las células se diluyeron adicionalmente con 150μΙ_ de solución de unión a anexina V diluida 10 veces y se analizaron inmediatamente mediante citometría de flujo. La dispersión frontal y lateral se utilizaron para seleccionar la población de células. Las barras del gráfico representan el porcentaje medio de células positivas a anexina de 4 ensayos diferentes.

I.14 Estadística.

Los resultados se presentaron como medias ± la desviación estándar. Se utilizó la prueba t de Student para el análisis estadístico entre los grupos y se consideró esta diferencia significativa cuando el valor p fue menor de 0,05 (*=P≤0,05, **=P≤0,01 , ***=P≤0,001).

II. RESULTADOS

2.1 Generación de las líneas resistentes a cisplatino.

Como primer paso en el estudio de los cambios metabólicos asociados a la resistencia a cisplatino en CPCNP, se obtuvieron líneas celulares resistentes.

Para hacer esto, partiendo de tres de las líneas celulares más comunes de CPCNP (A549 tumor primario, H1299 Nodulo linfático y H460 efusión pleural) se generaron líneas resistentes mediante tratamiento continuado con 5μΜ CDDP durante tres meses.

Después de este proceso de selección, las células fueron evaluadas para su sensibilidad al tratamiento con cisplatino (Figura 1A-C). Como cabría esperar de forma similar a lo que ocurre en pacientes, los resultados mostraron que el tratamiento continuado con CDDP sobre las líneas celulares condujo a la generación de un aumento en la resistencia a este tratamiento para las tres líneas celulares.

A pesar de que las curvas parecen similares, se observaron diferencias significativas para las 3 líneas celulares en el rango de concentración que va desde 3 a 12 μΜ

CDDP. Además, estos resultados se obtuvieron en un corto periodo de tiempo, 48 horas, por lo que, a mayores exposiciones, se esperaría un aumento de las diferencias entre las líneas parentales y las resistentes. Los siguientes experimentos se realizaron con 5μΜ cisplatino, ya que es una concentración baja, pero que permitió mostrar diferencias significativas para las 3 líneas del estudio.

Dado que el CDDP afecta el proceso de replicación del ADN, para excluir que el tratamiento CDDP continuo hubiera seleccionado células con un fenotipo y metabolismo más quiescentes, se estudió el ciclo celular de células parentales y resistentes a CDDP. Los resultados no mostraron diferencias en ninguna de las fases del ciclo celular (G1 , S, G2) entre las líneas celulares parentales y sus versiones resistentes a CDDP (Figura 1 E-F).

2.2 Líneas celulares resistentes a cisplatino muestran un aumento del metabolismo oxidativo y de la biogénesis mitocondrial.

Una vez se obtuvieron los tres modelos celulares de resistencia a CDDP, se procedió a caracterizar los cambios metabólicos asociados con este aumento estable de la resistencia (Figura 2). Se midió el consumo de glucosa, observándose una disminución del mismo para las líneas H1299 y H460 resistentes a CDDP (Figura 2A). Además, se calculó la relación entre la tasa de crecimiento celular en galactosa y glucosa, indicativa de la capacidad OXHPOS de las células. Los resultados muestran un aumento en este parámetro para las líneas H1299 y H460 resistentes a CDDP comparadas con sus versiones parentales (Figura 2B). Se midió el potencial interno mitocondrial (MIMP) ya que es un buen reflejo de la función mitocondrial y puede ser evaluado fácilmente por citometría de flujo con la sonda fluorescente TMRE. Los resultados mostraron un aumento significativo del MIMP para las líneas resistentes H1299 y H460 comparado con sus respetivas líneas parentales, pero no para la línea A549 (Figura 2C). Además, para confirmar el cambio en el metabolismo oxidativo, se evaluó el consumo de oxigeno de las células. Los resultados muestran, un aumento del consumo de oxígeno para las líneas H1299 y H460 resistentes a CDDP (Figura 2D).

Para explicar el mecanismo detrás del aumento en el consumo de oxígeno y de MIMP, se estudiaron los niveles de complejos OXPHOS por BN-PAGE en las líneas celulares H1299 y H460 en las que hubo un aumento neto en la función OXPHOS (Figura 2E).

Sorprendentemente, los resultados no mostraron diferencias significativas en la cantidad de supercomplejos mitocondriales I+II I2+IV. Una explicación para esta aparente contradicción (aumento en el consumo de oxígeno y MIMP pero no cambios en la cantidad de complejos) podría ser un aumento de la biogénesis mitocondrial. De esta manera, la red mitocondrial albergaría la misma densidad de complejos OXPHOS pero teniendo más masa mitocondrial, la cantidad total de complejos OXPHOS por célula sería mayor.

Para probar esta hipótesis, se midieron los niveles de masa mitocondrial utilizando la sonda molecular Mitotracker Green (MTG) (Figura 2F), así como a través de la inmunofluorescencia con el anticuerpo TOM20 (Figura 2G). Los resultados muestran un aumento de la masa mitocondrial para las líneas celulares H1299 y H460 resistentes a CDDP. Por otro lado, no se observaron cambios para la línea celular A549 resistente a CDDP. Curiosamente, esta línea celular tampoco mostró un aumento en la función OXPHOS.

Estos resultados se completaron con el análisis de los niveles de expresión de PGC-1a, conocido por ser el regulador principal de la biogénesis mitocondrial (Figura 2H). Los niveles de expresión de PGC-1a estaban aumentados significativamente en las líneas resistentes a CDDP H1299 y H460. Sin embargo, no se observaron cambios en la línea A549 resistente a CDDP, de forma similar a lo observado para los parámetros OXPHOS analizados.

2.3 Xenoinjertos derivados de pacientes (PDX) tratados con cisplatino muestran un aumento en PGC-1a y masa mitocondrial.

Se generaron cuatro modelos de PDX de 4 pacientes con CPCNP. Los ratones se distribuyeron aleatoriamente en dos grupos, controles y tratados con CDDP. Los tumores de dos de cuatro PDX mostraron un aumento en los niveles de PGC-1a (PDX6 y PDX8) después del tratamiento con CDDP (Figura 3A), no se observaron diferencias para PDX9 y PDX4 (datos no mostrados). Adicionalmente, para PDX6 y PDX8 la masa mitocondrial se evaluó mediante IHC de TOM20 (Figura 3B). En concordancia con sus niveles aumentados de PGC-1a, hubo un aumento significativo en la masa mitocondrial después del tratamiento con CDDP.

2.4 Inhibición OXPHOS en líneas de CPCNP parentales y resistentes a CDDP. A la vista de los resultados, parece claro que un mecanismo asociado al tratamiento con cisplatino sería un aumento del MIMP y de la biogénesis mitocondrial.

Profundizando en esta hipótesis, se investigó si este grupo de células resistentes con un MIMP aumentado podría ser atacado con una droga que inhiba la función mitocondrial o mediante el silenciamiento génico de PGC-1a mediante siRNAs.

Para estos estudios se trabajó con la línea celular H1299 ya que su versión resistente a CDDP es la que mostró un aumento mayor del MIMP. Además, se utilizó la línea A549 como control negativo ya que en esta línea no se observó este fenómeno.

Primero se comprobó si el silenciamiento de PGC-1a era capaz de reducir la masa mitocondrial. Utilizando un siRNA específico contra PGC-1a, se llegó aproximadamente a un 70% de reducción de la expresión de PGC-1a en comparación con los controles (Figura 4A). En estas condiciones, la interferencia de PGC-1a redujo la masa mitocondrial medida con MTG en las líneas celulares (Figura 4B). De forma interesante, las diferencias en la masa mitocondrial entre las células H1299 parentales y CDDP resistentes se pierden cuando se interfiere PGC-1 a.

Después, medimos la sensibilidad de las células al silenciamiento génico de PGC-1a (Figura 4C). La interferencia de PGC-1a disminuye el número de células viables para todos las líneas, sin embargo, este efecto fue mayor para la línea celular H1229 resistente a CDDP en comparación con su versión parental. Por otro lado, no se encontraron diferencias en la sensibilidad a la interferencia de PGC-1 a entre las líneas celulares A549 parental y resistente a CDDP. De hecho, la sensibilidad del siRNA de PGC-1a parece correlacionarse con la función OXPHOS medida.

A continuación, se comprobó si la droga metformina era capaz de reducir el MIMP de las líneas celulares. El tratamiento con metformina a las líneas A549 y H1299 disminuyó su MIMP independientemente de su resistencia a CDDP (Figura 4D). Además, se evaluó el efecto de diferentes concentraciones de metformina en la viabilidad celular de las líneas parentales y resistentes a CDDP (Figura 4E). Los resultados muestran una disminución de la viabilidad celular con un aumento de la concentración de metformina. De forma destacable, este efecto es mucho mayor en el caso de la línea H1299 resistente a CDDP comparado con su línea parental. Por el otro lado, no se observaron diferencias entre la línea A549 resistente a CDDP y su línea parental.

Por último, evaluamos la sensibilidad de las líneas celulares a la rotenona, un inhibidor específico del Complejo I mitocondrial (Figura 4F). De manera similar a la metformina, no hay diferencias significativas en la sensibilidad a la rotenona entre las células A549 parentales y resistentes a CDDP. Sin embargo, las células H1299 resistentes a CDDP son significativamente más sensibles a la rotenona que su versión parental.

2.5 El tratamiento con cisplatino induce una reprogramación metabolica en líneas celulares de CPCNP mediada por ROS independiente del ciclo celular.

Los resultados obtenidos con las líneas resistentes condujeron a preguntarse si estos cambios podían producirse como respuesta temprana a la droga. Con este propósito se analizaron los niveles de ROS, PGC-1a, Masa mitocondrial y MIMP en las líneas celulares tras 24 horas de tratamiento (Figura 5).

Dado que PGC-1a es inducido por ROS, primero se estudió si el cisplatino era capaz de aumentar los niveles de ROS en las líneas celulares. Para este propósito, se analizó los niveles de ROS 16h después del tratamiento con CDDP en las diferentes líneas celulares (Figura 5A). Los resultados mostraron un aumento en ROS cuando las células parentales se tratan con CDDP 5μΜ durante 16h. De manera similar, este cambio temprano de ROS en respuesta al tratamiento también ocurre en líneas resistentes, que aumentan aún más sus parámetros incrementados. Por lo tanto, este fenómeno parece ser común a las líneas celulares parentales y resistentes.

Luego se verificó que existía un proceso de reprogramación metabolica inducida por el tratamiento con CDDP a corto plazo. Evaluamos los niveles de PGC-1a (Figura 5B), masa mitocondrial (Figura 5C) y MIMP (Figura 5D) después de 24h de exposición a 5μΜ CDDP. Los resultados mostraron un aumento en todos los parámetros. Curiosamente, este aumento se produce en las 3 líneas celulares, aunque la línea resistente a CDDP A549 no tiene un aumento estable en ninguna de ellas. Asimismo, Este cambio temprano de MIMP y los ROS en respuesta al tratamiento ocurrió también en las líneas resistentes, que aumentaron aún más sus parámetros.

Además, esta reprogramación metabolica inducida por el tratamiento con CDDP se evitó mediante tratamiento concomitante con N-Acetil Cisteína (NAC) 10 mM, lo que indica que este proceso está mediado por ROS (Figura 5E).

Por otro lado, dado que el CDDP es un agente intercalante que dificulta la fase S, se analizó si este aumento de MIMP en tiempos cortos podría ser consecuencia de

alteraciones en el ciclo celular (Figura 5F). Para ello, midiendo el ciclo celular se observó que, efectivamente, el tratamiento con CDDP retiene a las células en la fase S-G2, disminuyendo la proporción de células en G1. Sin embargo, este efecto es menor en las líneas resistentes. En cuanto a la función mitocondrial, las células en fase S-G2 mostraron más MIMP, por lo tanto, parte del aumento que vimos se debe a que las células se detienen en esta fase. En cualquier caso, si comparamos las células dentro de la misma fase del ciclo celular, hay un aumento del MIMP independiente de la fase del ciclo celular inducido durante el tratamiento con CDDP.

2.6 Niveles de masa mitocondrial elevados mediante el tratamiento con ZLN005 reducen la apoptosis inducida por CDDP en células.

Para apoyar que el aumento de la masa mitocondrial es un mecanismo de resistencia a CDDP en CPCNP, se decidió incrementar los niveles de masa mitocondrial mediante otra aproximación para comprobar si así se reducía la sensibilidad a CDDP. El compuesto ZLN005 tras 48 horas de incubación aumentó los niveles de masa mitocondrial medidos mediante MTG o inmunofluorescencia de TOM20 en las tres líneas parentales A549, H1299 y H460. (Figura 6A). En estas condiciones, con una masa mitocondrial aumentada, se redujo la sensibilidad al CDDP en las líneas parentales (Figura 6B). De forma similar, el porcentaje de células apoptóticas, determinadas mediante mareaje positivo de Anexina V, se redujo de forma significativa en las líneas A549 y H1299 tratadas con ZLN005 (Figura6C).

2.7 Tratamiento concomitante basado en la inhibición OXPHOS y CDDP en líneas celulares parentales y resistentes a CDDP.

Ya que se observó un aumento en la Masa mitocondrial y MIMP como respuesta temprana al tratamiento con CDDP, se comprobó si el tratamiento conjunto con metformina, rotenona o PGC-1a siRNA podría aumentar el efecto del cisplatino.

Se procedió de una forma similar a la sección 2.4, primero se analizó si el siRNA era capaz de reducir el aumento temprano de masa mitocondrial inducido por CDDP (Figura 7A). Los resultados muestran que PGC-1a siRNA es capaz de controlar el aumento de la masa mitocondrial inducida por cisplatino en las dos líneas A549 y H1299, tanto para versiones parentales como resistentes a CDDP. Posteriormente, medimos la viabilidad celular usando PGC-1a siRNA en presencia de 5μΜ CDDP concomitante (Figura 7B). El silenciamiento de PGC-1 a aumenta el efecto de CDDP en todos los casos. Sin embargo, las diferencias en la sensibilidad de CDDP entre A549 parental y su versión resistente a CDDP se mantienen. Por otro lado, debido probablemente a una mayor sensibilidad al silenciamiento de PGC-1a en células H1299 resistentes a CDDP, se pierden las diferencias en la sensibilidad a CDDP entre las células H 1299 parentales y CDDP resistentes.

En segundo lugar, probamos si el tratamiento con metformina era capaz de revertir el aumento de MIMP producido por la exposición al CDDP (Figura 7C). El tratamiento con metformina restringe el aumento de MIMP inducido por CDDP para todos los casos. Además, el tratamiento con metformina o rotenona elimina las diferencias entre las líneas celulares parentales y resistentes al tratamiento con cisplatino para ambas líneas celulares (Figura 7 D-E). Las diferencias entre las células parentales y resistentes ya no son significativas a partir de una concentración de metformina 0,1 mM o rotenona 1 nM para las células A549, y de metformina 1 mM o rotenona 1 nM para las células H1299.

III. DISCUSIÓN

Se generaron versiones resistentes de tres líneas celulares diferentes después de un tratamiento continuado con cisplatino durante tres meses. Interesantemente, no presentaron cambios en las fases del ciclo celular. Sin embargo, dos de tres líneas celulares mostraron cambios estables hacia un aumento de la función OXPHOS (aumento de MIMP y masa mitocondrial), aunque curiosamente, las tres respondieron de manera similar con un aumento de estos parámetros como respuesta temprana al tratamiento de CDDP.

Los resultados aquí mostrados muestran un aumento de PGC-1a (activador de la función OXPHOS), precisamente en las dos lineas celulares (H 1299 y H460) que mostraron un aumento del MIMP, masa mitocondrial y consumo de oxigeno.

Apoyando la importancia de PGC-1a en el cambio metabolico, la línea celular A549 resistente al CDDP, sin cambios observados en el MIMP, no mostró un aumento en la expresión de PGC-1a. Estos resultados refuerzan un cambio específico estable en la función OXPHOS para las líneas celulares resistentes a CDDP de H1299 y H460.

De forma similar se observaron cambios tras el tratamiento con CDDP sobre modelos PDX, lo que refuerza que este fenómeno ocurra en los tumores de los pacientes de forma fisiológica.

Un aumento de la función OXPHOS puede conducir a un aumento de los niveles de superoxido y peróxido de hidrogeno. Los niveles de ROS medidos con DCFHDA estuvieron aumentados significativamente. Sorprendentemente, este aumento se produce tanto como una modificación estable en las líneas celulares CDDP resistentes y también como una respuesta temprana a la exposición a cisplatino en todas las líneas celulares estudiadas.

Todos estos resultados indican un proceso de reprogramación metabólica hacia una mayor función OXPHOS en contra el Efecto Warburg. La mayoría de las células tumorales utilizan preferentemente la estrategia de glicolisis aeróbica a pesar de su menor rendimiento energético (en comparación con el uso del sistema OXPHOS más eficiente) ya que este "metabolismo de Warburg" está adaptado para sostener un crecimiento exponencial. Sin embargo, como indican los resultados, hay un aumento en la función de OXPHOS tanto en células tratadas con CDDP como en células resistentes a CDDP de forma estable. Así, en este estudio se demuestra una reprogramación metabólica asociada con la resistencia y el tratamiento de este fármaco en este tipo de tumores. Este mecanismo de resistencia asociado al CDDP esta reforzado por el hecho de que un tratamiento farmacológico con el compuesto ZLN005 que induce un aumento de la masa mitocondrial produce un aumento en paralelo de la resistencia al CDDP, reduciendo la entrada en apoptosis de las células.

Se investigó la posibilidad de eliminar este grupo de células resistentes con una función OXPHOS aumentada inhibiendo la función mitocondrial, mediante diferentes tratamientos (Metformina, Rotenona y PGC-1a siRNA) y bajo diferentes abordajes (en solitario o en concomitancia con CDDP)

En el presente estudio se demostró que tanto el silenciamiento de PGC-1a, como el tratamiento con los inhibidores mitocondriales Metformina o Rotenona, reducían la viabilidad de las lineas celulares. Esta reducción fue mayor en la linea celular H1299 CDDP resistente en la que se observo un aumento de la función OXPHOS comparada con su versión parental. Sin embargo la linea A549 CDDP resistente para la cual no se observo un aumento en ningún parámetro OXPHOS mantuvo el mismo perfil de sensibilidad a los diferentes tratamientos.

Los resultados similares entre el efecto de la rotenona y la metformina refuerzan que la mayor sensibilidad a la metformina de las células H1299 resistentes a CDDP se debió a la capacidad de la metformina para inhibir el sistema OXPHOS y no a otros efectos no dependientes de OXPHOS atribuidos a la metformina. Estos resultados también respaldan que el efecto perjudicial de la inhibición de PGC-1a en la línea H1299 resistente se debe a su papel como responsable de mantener una función OXPHOS elevada. Por otro lado, estos datos confirman que existe un cambio metabólico estable hacia una mayor dependencia del sistema OXPHOS en la línea celular H1299 resistente a CDDP.

Por otro lado, el tratamiento concomitante de CDDP con metformina, rotenona o con el silenciamiento de PGC-1a, incrementa el efecto del CDDP, en todos los casos. De hecho, la terapia combinada de metformina o rotenona con CDDP elimina las diferencias de sensibilidad entre parentales y resistentes para ambas lineas celulares A549 y H1299. Asimismo, la terapia combinada de PGC-1 a y CDDP elimina las diferencias de sensibilidad entre parentales y resistentes para la linea H1299 pero no para la linea A549.

Para concluir, se puede decir que un aumento en la masa mitocondrial y por lo tanto de la función OXPHOS es un mecanismo de resistencia al tratamiento con cisplatino en NSCLC, y que esta característica de células resistentes a cisplatino puede ser aprovechada terapéuticamente mediante tratamiento con metformina, rotenona o interferencia del gen PGC-1 a.