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1. (WO2018233991) VERFAHREN ZUM TRENNEN VON NATURSTOFFGEMISCHEN MITTELS SCPC
Anmerkung: Text basiert auf automatischer optischer Zeichenerkennung (OCR). Verwenden Sie bitte aus rechtlichen Gründen die PDF-Version.

Verfahren zum Trennen von Naturstoffgemischen mittels sCPC

Besehreibung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Trennen von

Naturstoffgemischen, insbesondere solche aus Pflanzenextrakten und deren Isolierung und Aufreinigung als auch Gewinnung mittels Sequential Centrifugal Partition Chromatography

(sCPC) .

Der kontinuierliche TMB (True Moving Bed) Prozess als

Gegenstromverfahren verbindet die Vorteile der Flüssig-Flüssig Chromatographie mit denen eines kontinuierlichen Prozesses, wie zum Beispiel dem SMB (Simulated Moving Bed) unter Einsatz einer Zentrifugalsäule bzw. rotierende Trennsäule. Bei der Flüssig-Flüssig Chromatographie wird sowohl mit flüssiger mobiler Phase, als auch mit flüssiger stationärer Phase gearbeitet und kein festes Säulenmaterial eingesetzt. Im

Gegensatz zur SMB und deren verwandten Prozessen wird bei einer TMB die Bewegung der nicht-mischbaren Phasen nicht über eine Ventilschaltung erreicht, sondern über eine getaktete Phasenumkehr in einer ausgewählten Frequenz . Die grundlegende technische Lehre ist in WO 2005/011835 AI offenbart.

Charakteristisch ist der kontinuierliche Wechsel der

stationären Phase zur mobilen Phase und umgekehrt, d.h. es kann die dichtere oder weniger dichte Phase als mobile Phase ausgewählt werden und ein Wechsel dieser Auswahl ist während einer Trennung möglich. Daher wird diese präparative

Chromatographie als „Sequential Centrifugal Partition

Chromatography (sCPC)" bezeichnet. Die zu trennenden Stoffe A und B werden in einer Flüssig-Flüssig-Zentrifugalsäule

aufgrund eines unterschiedlichen Verteilungskoeffizienten mit verschiedenen Geschwindigkeiten in den beiden Phasen verschiedener Dichte bewegt.

Eine sCPC-Apparatur weist mindestens einen Rotor mit vielen runden Metallplatten auf in denen sich beispielsweise über Eintausend in Serie verbundene Trennkammern (auch Rotorkammern genannt unter Ausbildung einer rotierenden Trennsäule) befinden. Mit Hilfe einer Pumpe wird im Rotor die stationäre flüssige Phase von einer mobilen flüssigen Phase

(kontinuierlich) durchströmt. Der Rotor wird z.B. auf ca.

1.000 U/min und mehr beschleunigt, so dass die

Zentrifugalkraft die Trennung der beiden flüssigen Phasen aufgrund der Dichteunterschiede in den einzelnen Kammern bewirkt. Sobald die flüssige mobile Phase im Gleichgewicht (Equilibrium) mit der flüssigen stationären Phase liegt, kann die Probe bzw. das Substanzgemisch in den Rotor injiziert werden .

Die Stofftrennung erfolgt aufgrund verschiedener Adsorption in der mobilen bzw. stationäre Phase oder des jeweiligen

Verteilungskoeffizienten (K) eines Stoffes zur

mobilen/stationären Phase, wobei die Stoffe durch die

einzelnen Trennkammern zum Rotorausgang bewegt und

fraktioniert werden. Der charakteristische alternierende

Wechsel von stationärer Phase und mobiler Phase erfolgt durch Steuerung der eingesetzten Pumpen mittels Ventilen in einer zu wählenden Frequenz. In einer zu wählenden Zeitdauer („Duration of pumping, Pumpdauer") wird zu der jeweils angesteuerten Phase das zugehörige Lösungsmittel eingepumpt und zwar jeweils an den beiden Enden eines Rotors, so dass die Pumpen

entgegengesetzt angeordnet sind.

Die Probe bzw. das Substanzgemisch wird vorzugsweise intermediär in den Rotor eingespeist. In einer weiteren

Ausführungsform können zwei oder mehrere Rotoren gekoppelt werden .

Ein prinzipieller Zyklus stellt sich in Figur 1 abgebildet dar .

Die Rotorkammern werden vorzugsweise im Verhältnis 50/50 (Volumen %) mit einer oberen und einer unteren flüssigen Phase befüllt. Das Substanzgemisch wird mittels Pumpen

kontinuierlich zwischen die beiden rotierenden Trennsäulen mit einer definierten Flussrate eingespeist und die Trennung erfolgt zyklisch und zeitversetzt, wobei in einem ersten

Schritt die obere Phase als mobile Phase dient („Ascending" ) und in einem zweiten Schritt die untere Phase als mobile Phase dient („Descending" ) .

Entsprechend der Konzentration und der unterschiedlichen

Verteilungskoeffizienten der Substanzen im Substanzgemisch erfolgt die Auftrennung in zwei Produktströme, siehe Figur 1.

Geeignete Geräte und Apparaturen können von Armen Technologies (Frankreich) unter dem Namen „True Moving Bed CPC" erhalten werden .

Im Stand der Technik sind zu sCPC die Aufreinigung von

Modellsubstanzen und binären Gemischen beschrieben (Göll, Johannes, Andreas Frey, and Mirjana Minceva. "Study of the Separation limits of continuous solid Support free liquidliquid chromatography: Separation of capsaicin and

dihydrocapsaicin by centrifugal partition chromatography." Journal of Chromatography A 1284 (2013) : 59-68; Hopmann E, Göll J, Minceva M. Sequential centrifugal partition chromatography : A new continuous Chromatographie technology. Chem Eng Technol. 2012 ; 35 ( 1 ) : 72-82 ; hier: binäres Gemisch aus Capsaicin und Dihydrocapsaicin) , jedoch nicht Verfahren zur Trennung und/oder Reinigung von Naturstoffen aus

Pflanzenextrakten und zwar zur Herstellung von Fraktionen und Reinstoffen .

Daher betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Trennung und/oder Reinigung von Naturstoffen aus Pflanzenextrakten, enthaltend mindestens einen Flüssig-flüssig- Verteilungschromatographieschritt , wobei ein kontinuierlicher Wechsel der stationären Phase zur mobilen Phase und umgekehrt erfolgt (sCPC) , wobei eine oder mehrere Fraktionen abgetrennt wird/werden .

Daher betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Trennung und/oder Reinigung von Naturstoffen aus Pflanzenextrakten, enthaltend mindestens einen Flüssig-flüssig- Verteilungschromatographieschritt , wobei ein kontinuierlicher Wechsel der stationären Phase zur mobilen Phase und umgekehrt erfolgt (sCPC) , wobei mindestens ein Reinstoff abgetrennt wird .

Im Rahmen dieser Erfindung wird unter einem „Pflanzenextrakt" ein Vielkomponentengemisch aus Naturstoffen verstanden, welches mehr als zwei Naturstoffe, insbesondere mehr als 10 oder 100 Naturstoffe, insbesondere mehr als 200, 300, 500 oder 1.000 Naturstoffe enthält. Pflanzenextrakte können

beispielsweise mittels Extraktion, Perkolation oder Mazeration aus Pflanzenmaterialien gewonnen werden. Als Extraktionsmittel können Lösungsmittel, wie Wasser, Cl-C5-Alkohole, Ethanol,

oder andere Lösungsmittel mit ausreichender Polarität eingesetzt werden. Eine übliche Extraktion ist beispielsweise ein Gemisch aus Wasser / Ethanol (50:50, 70:30, 30:70) bei 70 Grad Celsius. Weiterhin sind solche Pflanzenextrakte

erfindungsgemäß bevorzugt, die weniger als 50 Gewichts-% oder 40 Gewichts-% Fette oder Lipide aufweisen, insbesondere weniger als 20 Gewichts-% oder 10 Gewichts-% Fette oder

Lipide, da Fette zu einer Beeinträchtigung der Trennleistung im sCPC-Verfahren führen können.

Nachstehende Gattungen sind für die Pflanzenextrakte

erfindungsgemäß bevorzugt:

Equiseti, Juglandis, Millefolii, Quercus, Taraxaci, Althaeae, Matricariae, Centaurium, Levisticum, Rosmarinus, Angelica, Artemisia, Astragalus, Leonurus, Salvia, Saposhnikovia,

Scutellaria, Siegesbeckia, Armoracia, Capsicum, Cistus,

Echinacea, Galphimia, Hedera, Melia, Olea, Pelargonium,

Phytolacca, Primula, Salix, Thymus, Vitex, Vitis, Rumicis, Verbena, Sambucus, Gentiana, Cannabis, Silybum.

Nachstehende Arten sind für die Pflanzenextrakte

erfindungsgemäß bevorzugt:

Equiseti herba (Schachtelhalmkraut) , Juglandis folium

(Walnussblätter) , Millefolii herba ( Schafgarbenkraut ) , Quercus cortex (Eichenrinde) , Taraxaci herba (Löwenzahnkraut) ,

Althaeae radix (Eibischwurzel) und Matricariae flos (bzw. Flos chamomillae (Kamilleblüten) ) , Centaurium erythraea

(Tausendgüldenkraut) , Levisticum officinale (Liebstöckel) , Rosmarinus officinalis (Rosmarin) , Angelica dahurica

(Sibirische Engelwurz, PinYin Name: Baizhi) , Angelica sinensis (Chinesische Angelika, PinYin Name: Danggui) , Artemisia scoparia (Besen-Beifuß, PinYin Name: Yinchen) , Astragalus membranaceus (var . Mongolicus) (Traganthwurzel, Chin . : Huang-Qi) , Leonurus japonicus (Löwenohr, Chin.: T'uei ), Salvia miltiorrhiza (Rotwurzel-Salbei, Chin.: Danshen) , Saposhnikovia divaricata (Siler, PinYin Name: Fangfeng) , Scutellaria

baicalensis (Baikal-Helmkraut, Banzhilian) , Siegesbeckia pubescens (Himmlisches Kraut, PinYin Name: Xixianciao) ,

Armoracia rusticana (Meerrettich) , Capsicum sp . (Paprika) , Cistus incanus (Zistrose) , Echinacea angustifolia (Sonnenhut) , Echinacea purpurea (Sonnenhut), Galphimia glauca, Hedera helix

(Efeu), Melia toosendan (Chinesische Holunderfruchte, Chin.: Chuan Lian Zi) , Olea europaea (Olive), Pelargonium sp .

(Pelagornien) , Phytolacca americana (Kermesbeeren) , Primula veris (Schlüsselblume) , Salix sp . (Weide), Thymus L.

(Thymian) , Vitex agnus castus (Mönchspfeffer) , Vitis vinifera

(Edle Weinrebe) , Rumicis herba (Sorrel herb), Verbena

officinalis (Eisenkraut), Sambucus nigra (Schwarzer Holunder), Gentiana lutea (Gelber Enzian) , Cannabis sativa (Hanf) ,

Silybum marianum (Mariendistel) .

Ebenfalls sind Mischungen der vorstehenden Gattungen und / oder Arten erfindungsgemäß umfasst.

Vorstehende Arten und Gattungen sind besonders reich an heilbringenden Naturstoffen und sind als

Arznei (mittel ) pflanzen beschrieben, wie z.B. in den Produkten auf der Basis von Pflanzenextrakten der Bionorica SE (z.B. Bronchipret®, Imupret®, Sinupret®) . Ferner weisen solche

Pflanzen übliche charakteristische Stoffklassen an

Naturstoffen auf, wie Sekundärmetaboliten, wie Flavonoide, Polyphenole, etc. Solche Arzneipflanzen dienen zum

Bereitstellen von Arzneimitteln.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Pflanzenextrakt aus einem ersten Lösungsmittel, wie Alkohole, Ethanol, Wasser, Kohlenwasserstoffe, Heptan oder Mischungen davon gewonnen, und die löslichen Anteile in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt (nach-, vorstehend: Substanzgemisch) .

Zum erfindungsgemäßen Verfahren zur Trennung und/oder

Reinigung von Naturstoffen aus Pflanzenextrakten mittels sCPC werden die kritischen Prozessparameter, nämlich Flussrate (flow rate) der oberen Phase, Flussrate der unteren Phase, Substanzgemisch-Flussrate, Zykluszeit „Descending" und

Zykluszeit „Ascending" vorzugsweise gemäß folgenden Schritte durchgeführt :

- Festlegen einer definierten Konzentration des

Substanzgemisches im ausgewählten Lösungsmittelsystem;

Festlegen der maximalen Flussrate für die untere und obere Phase bei der kein unkontrolliertes Phasenbluten der flüssigen Phasen stattfindet;

- Festlegen der maximalen Substanzgemisch-Flussrate;

Anpassen der Zykluszeit des Descending und / oder

Ascending Modus um den Schnittpunkt der Trennung im

Chromatogramm beliebig zwischen unterschiedlichen

Substanzen zu verschieben, vorzugweise werden kurze

Schaltzeiten verwendet um ein unkontrolliertes

Phasenbluten und Austreten von nicht aufgetrennten

Substanzen zu vermeiden.

Dieses Vorgehen erlaubt die gezielte An- und Abreicherung als auch Abtrennung von Fraktionen oder von Reinstoffen, wie zum Beispiel nicht abschließend Cannabidiol, Tetrahydrocannabinol , Casticin, Gentiopikrosid, Agnusid, Chamazulen, Primulasaponin 1 , u.a.

Beispielsweise können in den Fraktionen solche Stoffklassen von Pflanzenextrakten, wie Alkaloide, Bitterstoffe,

Anthocyanine, Anthrachinone, Coumarine, Flavonoide,

Glucosinolate, Lactone, Lignane, Lipide, Cannabinoide,

Phenole, Polyphenole, Saponine, Terpene, Xanthone an- oder abgereichert werden, die abgetrennt werden können.

Besonders vorteilhaft können solche Fraktionen und Reinstoffe in hoher Reinheit und Ausbeute erhalten werden.

Zum Einsatz kommende Lösungsmittel können bei der Flüssig-Flüssig Verteilungschromatographie beispielsweise Skalicka-Wozniak K, Garrard I, A comprehensive Classification of solvent Systems used for natural product purifications in countercurrent and centrifugal partition chromatography, Nat Prod Rep . 2015 Nov; 32 (11) : 1556-61 entnommen werden.

Erfindungsgemäße Beispiele für geeignete Lösungsmittel aus denen zweiphasige Lösungsmittelsysteme (mobile Phase /

stationäre Phase) für Pflanzenextrakte bereitgestellt werden können, sind:

a . ) Kohlenwasserstoffe wie n-Hexan, Cyclohexan, Isohexan,

Heptan, Isooctan;

b. ) Ether wie t-Butylmethylether, Petrolether,

Diethylether;

c. ) Halogenierte Lösungsmittel wie Chloroform,

Dichlormethan, Benzotrifluorid, Dichlorethan,

Tetrachlormethan, Trichlorethan;

d. ) Wasser-Lösliche Alkhole wie Butanol, Methanol, Ethanol,

Isopropanol;

e. ) Wasser-Lösliche Ester wie Ethylacetat, Isopropylacetat ;

f. ) Acetonitril, Toluol.

Aus diesen vorgenannten Lösungsmitteln lassen sich geeignete zweiphasige Lösungsmittelsysteme herstellen, vorzugsweise solche wie, insbesondere zumindest enthaltend:

n-Heptan und/oder Acetonitril, n-Heptan/Acetonitril

n-Heptan/Ethylacetat /Acetonitril ;

n-Heptan/Ethylacetat /t-Butylmethylether/ Acetonitril;

n-Heptan/Ethy1acetat /Methanol /Wasser;

n-Heptan/Ethanol /Wasser .

Daher betrifft die Erfindung ebenfalls ein Verfahren zur

Trennung und/oder Reinigung von Naturstoffen aus

Pflanzenextrakten, enthaltend mindestens einen Flüssig-flüssig-Verteilungschromatographieschritt , wobei ein

kontinuierlicher Wechsel der stationären Phase zur mobilen Phase und umgekehrt erfolgt, und die stationäre Phase als auch mobile Phase aus mindestens zwei Lösungsmitteln ausgewählt sind aus der Gruppe Kohlenwasserstoffe mit 5 - 8

Kohlenstoffatomen, insbesondere n-Heptan, Acetonitril,

Ethylacetat, t-Butylmethylether, Alkohole, insbesondere

Methanol, Wasser, Ethanol, n-Heptan und / oder Acetonitril, so dass ein zwei-Phasen-System erhalten werden kann.

Ganz besonders bevorzugt sind jedoch n-Heptan und / oder

Acetonitril zur Auftrennung der Pflanzenextrakte mittels dem erfindungsgemäßen sCPC-Verfahren . Weiterhin ist zur optimalen Trennung der Pflanzenextrakte bevorzugt, dass der Rotor auf eine Rotation zur Durchführung des erfindungsgemäßen

Verfahrens auf mehr als 2.000 U/min (rpm) , insbesondere 2.500 U/min (rpm) und mehr beschleunigt wird.

Nachfolgende Beispiele und Figuren dienen ausschließlich zur Erläuterung der Erfindung, ohne die Erfindung auf diese

Beispiele zu beschränken.

Beispiel 1 :

Darstellung eines Equipments:

Ausrüstung :

Kontinuierlicher Flüssig-Flüssig Chromatograph True-Moving-Bed (TMB) 500 System, mit 2x250 mL Rotor, Drehzahl 100-3000 rpm, bis 100 mL/min Flussrate, 100 bar Maximaldruck von Armen

Instruments (Saint-Ave, Frankreich) oder 12 L

Produktionsanlage mit 2x6L Rotor.

Zusat zausrüstung :

2xEluenten-Pumpe, bis 100 mL/min Flussrate; 2xProbenaufgabe-Pumpe, bis 50 mL/min Flussrate; 2xDioden-Array-Detektor Ecom, 4 Wellenlängen, 200-600 nm Detektionsbereich, 6 kg;

2xFraktionensammler LS-5600, inkl. Rack-Set aus Edelstahl, 20 kg

Funktionsweise :

Die Probe bzw. das Substanzgemisch wird kontinuierlich, phasenweise auf beide Rotoren injiziert und die

Probenkomponenten nach Polarität und gemäß ihrer flüssig-flüssig-Verteilungskoeffizienten K mit einem geeigneten

Zweiphasigen Lösungsmittelsystem getrennt. Nach Anfahren der Anlage stellt sich ein stationärer, steady-state Zustand ein. An einem Rotor kann anschließend mittels eines

Fraktionensammlers Produktseite A entnommen werden.

Abwechselnd kann am zweiten Rotor mit einem weiteren

Fraktionensammler Produktseite B entnommen werden kann. Die Detektoren dienen zur Überwachung der Trennung.

Beispiel 2 :

Nutzhanfextrakt unter Abreicherung von THC

Gewinnung von Nutzhanfextrakt THC-befreit: Extraktion Cannabis herbe mittels CO2, Decarboxylierung bei 120°C im Vakuum,

Auflösen in n-Heptan/Ethanol/Wasser,

Methode :

Parameter :

Rotation: 2600 rpm

Ascending Modus:

Flow rate Elution: 30 ml/min

Flow rate Injection: 10 ml/min / 5 ml/min

Pumpdauer: 90 sec.

Descending Modus:

Flow rate Elution: 30 ml/min

Flow rate Injection: 10 ml/min / 5 ml/min

Pumpdauer: 99 sec.

Flow rate = Flussrate

Trennung von 3,05 g Ausgangsprodukt (50g/L) in 30 min in Batchbetrieb mit n-Heptan/Ethanol/Wasser (5:4:1.4) - die vertikale Linie bei 17:00 beschreibt die Trennlinie bei der späteren kontinuierlichen Verteilungschromatographie.

Trennung im kontinuierlichen Betrieb (50g/L) mit der SCPC mit n-Heptan/Ethanol/Wasser (5:4:1.4)

Grau: UV-Signal Descending Seite, Schwarz: UV-Signal Ascending Seite

HPLC-Chromatogramm der Ascending Seite

Gehaltsanalyse: CBD : 0,00%, D9-THC: 2,63%, CBN: 2,84%

Beispiel 3:

Aufreinigung von Casticin

Parameter :

Rotation : 2600 rpm

Ascending Modus:

Flow rate Elution 15 ml/min

Flow rate Injection: 5 ml/min

Pumpdauer : 30 sec.

Descending Modus:

Flow rate Elution: 15 ml/min

Flow rate Injection: 5 ml/min

Pumpdauer : 60 sec.

HPLC Chromatogramm Ausgangsprodukt Essi Agni Casti

Lösungsmittelsystem: n-Heptan / Ethanol / Wasser (5 (v / v / v)

Gehalt an Casticin im Trockenextrakt: 0,145% (m/m)

Batch Verteilungschromatographie (CPC) :

Trennung von 1 g Essi Agni Casti im Batchbetrieb mit n- Heptan/Ethylacetat /Ethanol/Wasser (7:10:7:10) - die vertikalen Linien bei 22:00 und 28:00 beschreiben die Trennungen bei der späteren kontinuierlichen Verteilungschromatographie.

True Moving Bed Aufreinigungsschritt 1 zur Voranreicherung:


Gehalt an Casticin: 60,3% (m/m)

True Moving Bed Aufreinigungsschritt 2 zur Voranreicherung:

PAP Spektrum (oben) und HPLC Chromatogramm (unten] aufgereinigtes Casticin nach TMB

Gehalt an Casticin: 98,3% (m/m)

HPLC-Chromatogramm des Ausgangsproduktes Essi Agni Casti

Gehalt an Casticin im Trockenextrakt: 0,145% (m/m)

Lösungsmittelsystem: n-Heptan / Ethylacetat / Ethanol / Wasser (7 : 10 : 7: 10) (v / v / v / v)

Beispiel 4 :

Aufreinigung Chamazulen

GC-Chromatogramm des Ausgangsproduktes Oleum Chamomillae:

Gehalt an Chamazulen im Ätherischen Öl: 15,8% (m/m)

Batch Verteilungschromatographie (CPC) :

Trennung von 0,5 g Oleum Chamomillae im Batchbetrieb mit n- Heptan/TBME/Acetonitril (4:2:4) - die blauen Linien

beschreiben die Trennungen bei der späteren kontinuierlichen

VerteilungsChromatographie

1. TMB Schritt

Parameter :

Rotation : 2600 rpm

Ascending Modus:

Flow rate Elution: 15 ml/min

Flow rate Injection: 5 ml/min

Pumpdauer : 90 sec.

Descending Modus:

Flow rate Elution: 15 ml/min

Flow rate Injection: 5 ml/min

Pumpdauer : 75 sec.

Lösungsmittelsystem: n-Heptan/TBME/Acetonitril (4 : 2 : 4) (v / v / v )

Trennung von Oleum Chamomillae (25 g/L) im kontinuierlichen Betrieb mit der SCPC mit n-Heptan/Ethylacetat /Ethanol/Wasser (7:10:7:10) als Aufreinigungsschritt 1

Gehalt an Chamazulen nach Voranreicherung TMBl: 70,3% (m/m)

2. TMB Schritt

Parameter :

Rotation : 2600 rpm

Ascending Modus:

Flow rate Elution: 15 ml/min

Flow rate Injection: 5 ml/min

Pumpdauer : 30 sec.

Descending Modus:

Flow rate Elution: 15 ml/min

Flow rate Injection: 5 ml/min

Pumpdauer: 60 sec.

Lösungsmittelsystem: n-Heptan/TBME/Acetonitril (4 : 2 : 4) (v / v / v )

2. TMB Schritt Kontinuierliche Verteilungschromatographie (SCPC) :

Trennung des Materials aus TMB-Schritt 1 (25 g/L) im

kontinuierlichen Betrieb mit der SCPC mit n- Heptan/TBME/Acetonitril (4 : 2 : 4) als Aufreinigungsschritt 2.

PAP Spektrum (oben) und GC Chromatogramm (unten)

aufgereinigtes Chamazulen nach TMB Aufreinigungsschritt 2:


Gehalt an Chamazulen: 99,0% (m/m)

Beispiel 5:

Aufreinigung Primulasaponine

Essi Primula veris

Gehalt an Primulasaponin 1 im Extrakt: -20% (m/m) Batch Verteilungschromatographie (CPC)

Trennung von 0,1 g Essi Primula veris im Batchbetrieb mit n- Heptan/Ethylacetat /Wasser (6:5:4) - die blauen Linien beschreiben die Trennungen bei der späteren kontinuierlichen VerteilungsChromatographie

1. TMB Schritt

Parameter :

Rotation : 2600 rpm

Ascending Modus:

Flow rate Elution: 15 ml/min

Flow rate Injection 5 ml/min

Pumpdauer : 90 sec.

Descending Modus:

Flow rate Elution: 15 ml/min

Flow rate Injection: 5 ml/min

Pumpdauer: 75 sec.

Lösungsmittelsystem: n-Heptan/Ethylacetat /Wasser (6:5:4) (v / v / v )

Trennung von Essi Primula veris (5 g/L) im kontinuierlichen Betrieb mit der SCPC mit n-Heptan/Ethylacetat /Wasser (6:5:4) als Aufreinigungsschritt 1

Gehalt an Primulasaponin 1 nach Voranreicherung TMBl: 60,1% (m/m)

2. TMB Schritt

Parameter :

Rotation: 2600 rpm

Ascending Modus:

Flow rate Elution: 15 ml/min

Flow rate Injection: 5 ml/min

Pumpdauer: 30 sec.

Descending Modus:

Flow rate Elution: 15 ml/min

Flow rate Injection: 5 ml/min

Pumpdauer: 60 sec.

Lösungsmittelsystem: n-Heptan/Ethylacetat /Wasser (6:5:4) (v / v / v )

2. TMB Schritt Kontinuierliche Verteilungschromatographie

(SCPC)

Trennung des Materials aus TMB-Schritt 1 (5 g/L) im

kontinuierlichen Betrieb mit der SCPC mit n- Heptan/Ethylacetat /Wasser (6:5:4) als Aufreinigungsschritt 2

PAP Spektrum (oben) und HPLC Chromatogramm (unten)

aufgereinigtes Primulasaponin 1 nach TMB Aufreinigungsschritt

2 :