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1. (WO2018229259) ENZYMPRODUKT MIT BETA-GALAKTOSIDASE
Anmerkung: Text basiert auf automatischer optischer Zeichenerkennung (OCR). Verwenden Sie bitte aus rechtlichen Gründen die PDF-Version.

P a t e n t a n s p r ü c h e

1 . Enzymprodukt umfassend ein beta-Galaktosidaseprodukt

dadurch gekennzeichnet,

dass das beta-Galaktosidaseprodukt eine inaktive Arylsulfatase aufweist.

2. Enzymprodukt nach Anspruch 1 ,

dadurch gekennzeichnet,

dass das beta-Galaktosidaseprodukt eine Laktase aus Kluyveromyces lactis enthält.

3. Enzymprodukt nach Anspruch 1 oder 2,

dadurch gekennzeichnet,

dass das beta-Galaktosidaseprodukt eine Laktase aus Kluyveromyces lactis 21 B7 umfasst, insbesondere die Laktase von zumindest einem der hinterlegten Stämme CBS142344, CBS142345 und CBS142346.

4. Enzymprodukt gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche,

dadurch gekennzeichnet,

dass ein Gen für die Arylsulfatase mittels Genom-Editierungs-Verfahren durch die Verwendung von künstlichen Nukleasen und/oder von programmierbaren Nukleasen der CRISPR-Technologie inaktivierbar ist, insbesondere durch die Verwendung einer Zink- Finger-Nuclease und/oder Transcription Activator-Like Effector Nuclease.

5. Enzymprodukt gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche,

dadurch gekennzeichnet,

dass die Arylsulfatase durch Genom-Editierungsverfahren, insbesondere durch die Anwendung der CRISPR-Technologie mit Klasse II cas-Endonukleasen, insbesondere cas9 oder cpfl , auf Genom-Ebene inaktiviert ist.

6. Enzymprodukt erhältlich durch eine insbesondere neutrale Laktase aus Kluyveromyces lactis, zur Herstellung eines beta-Galaktosidaseproduktes, das im Wesentlichen frei von Arylsulfatase-Aktivität ist.

7. Enzymprodukt nach Anspruch 6,

dadurch gekennzeichnet,

dass das im Wesentlichen arylsulfatasefreie beta-Galaktosidaseprodukt aus einem Produktionsorganismus, modifiziert mittels Genom-Editierungs-Technologien, insbesondere durch CRISPR-Cas9-Technologie, hergestellt worden ist.

8. Verfahren zur Herstellung eines beta-Galaktosidaseproduktes, wobei das beta- Galaktosidaseprodukt eine inaktive Arylsulfatase enthält, umfassend zumindest einen der folgenden Schritte:

a) Bestimmung einer Zielsequenz des zu inaktivierenden Gens im Produktionsstamm, vorzugsweise K. lactis 21 B7,

b) Konstruktion eines Vektors, enthaltend Cas9 und eine sgRNA spezifisch für das Gen der Arylsulfatase des beta-Galaktosidase-produzierenden Stammes, vorzugsweise K. lactis 21 B7,

c) Transformation des beta-Galaktosidase-produzierenden Stammes, vorzugsweise K. lactis 21 B7,

d) Sequenzierung der Zielsequenz in den Transformanten zur Überprüfung der erfolgreichen Deletion oder Einführung von einzelnen Nukleotiden e) Entfernung des Vektors aus b) durch Kultivierung erzeugter/bestätigter Knock- Out-Mutanten unter nicht-selektiven Bedingungen,

f) Permeabilisierung der Knock-Out-Mutanten durch chemische Behandlung, g) Trennung des Permeats von der Biomasse (aus Schritt c)),

h) Bestimmung der Enzymaktivitäten von beta-Galaktosidase und Arylsulfatase im Permeat (Verhältnis Arylsulfatase Units/Neutrale Laktase Units, ASU/NLU).

9. Verwendung eines Produkts einer neutralen beta-Galaktosidase aus K. lactis zur Herstellung eines Enzymproduktes gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7.