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1. WO2017085170 - VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON AMINOBENZOESÄURE ODER EINES AMINOBENZOESÄUREDERIVATS

Anmerkung: Text basiert auf automatischer optischer Zeichenerkennung (OCR). Verwenden Sie bitte aus rechtlichen Gründen die PDF-Version.

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VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON AMINOBENZOESÄURE ODER EINES AMINOBENZOESÄUREDERIVATS

Die vorliegende Erfindung befasst sich mit einem Verfahren zur Herstellung von Ammobenzoesäure oder eines Ammobenzoesäurederivats durch Fermentation eines geeigneten Rohstoffes unter dem Einfluss geeigneter Mikroorganismen unter Erhalt einer Aminobenzoat und/oder Ammobenzoesäure umfassenden Fermentationsbrühe. Insbesondere befasst sich die vorliegende Erfindung mit dem Schritt der Gewinnung der Ammobenzoesäure aus der Fermentationsbrühe, wobei die Kristallisation von Ammobenzoesäure durch eine bloße einstufige Säurebehandlung in Gegenwart von Impfkristallen durchgeführt wird. Die so auf einfache Weise auskristallisierte Ammobenzoesäure kann leicht aus der Mutterlauge abgetrennt, erforderlichenfalls weiter gereinigt und dann den verschiedensten Anwendungszwecken zugeführt werden.

Die fermentative Herstellung von Ammobenzoesäure bzw. von Produkten, die durch weitere chemische Umwandlung von Ammobenzoesäure erhalten werden können (nachfolgend Aminobenzoesäurederivate) ist in der Literatur beschrieben. Für die fermentative Herstellung von Ammobenzoesäure sei beispielhaft auf Balderas-Hemandez, V. E. et al,„Metabolie engineering for improving anthranilate synthesis from glucose in Escherichia coli", Microb. Cell. Fact. 2009, 8, 19 (doi: 10.118611475-2859-8-19) verwiesen. Auch in der Patentliteratur finden sich hierzu Veröffentlichungen; siehe beispielsweise WO 2015/124686 AI und WO 2015/124687 AI sowie die darin jeweils zitierte Literatur. Produkte, die durch weitere chemische Umwandlung von Ammobenzoesäure erhalten werden können, werden von Wiklund et al. beschrieben (Per Wiklund et al., Current Organic Synthesis, 2006, 3, 379 - 402).

Auch andere Säuren wie L-Aminosäuren oder Nukleinsäuren wurden bereits fermentativ hergestellt, wie in EP 2 130 924 AI beschrieben. In dem dort beschriebenen Verfahren fällt das gewünschte Produkt bereits in der Fermentationsbrühe aus, sodass auf einen separaten Kristallisationsschritt verzichtet werden kann. Optional werden während der Fermentation Impfkristalle zugegeben.

In S. Gracin et al, Crystal Growth & Design, 2004, 4, 1013 - 1023 werden der Polymorphismus und die Kristallisation von para- Ammobenzoesäure diskutiert. Die Schrift geht nicht auf Besonderheiten bei der Isolierung von para-Aminobenzoesäure aus Fermentationsbrühen ein. Die Isolierung einer Zielverbindung aus einer Fermentationsbrühe ist aber alles andere als trivial. Sie kann eine Reihe von Schritten wie Extraktion, Filtration, Adsorption oder Kristallisation umfassen.

Es ist sogar möglich, dass alle diese Schritte erforderlich sind, um die gewünschte Zielverbindung in ausreichender Reinheit zu erhalten. Jeder dieser Schritte verursacht jedoch unweigerlich Mehraufwand und damit Kosten. Außerdem ist die Ausbeute an der Zielverbindung umso geringer, je mehr Schritte zu ihrer Isolierung erforderlich sind. Daher ist es generell wünschenswert, die Zahl der Schritte bis zur Isolierung der Zielverbindung in der gewünschten Reinheit möglichst klein zu halten.

Fermentationsprozesse laufen in der Regel in einer wässrigen Umgebung ab. Es ist daher insbesondere wünschenswert, die durch Fermentation hergestellte Zielverbindung direkt aus dieser wässrigen Umgebung isolieren zu können und etwa auf ein Herauslösen mittels eines organischen Lösungsmittels verzichten zu können.

Es ist allgemein bekannt, dass die Löslichkeit von ortho-Aminobenzoesäure als amphoterer Verbindung durch gezielte Einstellung des pH- Werts minimiert werden kann. Die beiden pKs-Werte liegen bei 2,2 bzw. 4,9 (vgl. Zapala et al, Biophys. Chem., 140 (1-3) (2009) 91 - 98), was mit einem Löslichkeitsminimum bei einem pH- Wert von etwa 3,5 korrespondiert.

Es wäre daher eigentlich zu erwarten, dass die Isolierung von ortho-Aminobenzoesäure aus Fermentationsbrühen ohne großen Aufwand möglich sein sollte. Im vollkommenen Gegensatz dazu beschreibt JP04-330290A einen mehrstufigen Prozess zur Isolierung von ortho-Aminobenzoesäure, in welchem

(1) optional und bevorzugt, durch eine pH- Wert- Anpassung der Fermentationsbrühe auf einen pH-Wert von 4 bis 6 in der Fermentationsbrühe vorhandene Proteine ausgefällt werden,

(2) die Biomasse aus der Fermentationsbrühe abgetrennt (und diese somit„sterilisiert") wird, dann

(3) durch eine pH- Wert- Anpassung auf einen pH-Wert von 5 bis 10 und anschließende Adsorption an einer geeigneten Säule eine Entfärbung bewirkt wird,

(4) die ortho-Aminobenzoesäure enthaltende Lösung aufkonzentriert wird, bevor

(5) auch nur damit begonnen werden kann, ortho-Aminobenzoesäure durch pH- Wert-Anpassung auf den dem isoelektrischen Punkt von ortho-Aminobenzoesäure entsprechenden pH-Wert auszukristallisieren, wonach schließlich

(6) die ausgefallenen Kristalle abgetrennt werden.

Das Verfahren umfasst also zwei bis drei Schritte der pH- Wert-Anpassung und ist daher im Hinblick auf die zur Kristallisation erforderliche Einstellung des pH- Werts mehrstufig. Darüber hinaus weist die aufwändig in fünf bis sechs Schritten isolierte ortho-Aminobenzoesäure nur eine Reinheit von 94 % auf und wird auch nur in einer relativ niedrigen Ausbeute von 67 % der theoretisch möglichen Ausbeute erhalten. Das Verfahren ist komplex und erfordert eine zwei- bis dreimalige pH- Wert-Änderung, was naturgemäß mit einer erhöhten Salzfracht der Abwässer einhergeht. Außerdem ist ortho-Aminobenzoesäure temperaturempfindlich und kann zum Ammobenzoesäurederivat Anilin decarboxylieren. Letzteres ist selbst dann problematisch, wenn Anilin das eigentliche Zielprodukt der Synthesesequenz ist, denn eine vorzeitige Decarboxyherung an dieser Stelle kann zu Ausbeuteverlusten infolge einer vergleichsweise hohen Wasserlöslichkeit von Anilin bei den relevanten pH- Werten führen. Eine möglichst rasche Isolierung der ortho-Aminobenzoesäure bei möglichst niedriger Temperatur ist daher wünschenswert.

WO 2015/124687 AI offenbart auf S. 17 die Gewinnung von ortho-Aminobenzoesäure (Anthranilsäure) aus einer Fermentationsbrühe durch Säurezugabe in allgemeiner Weise, lehrt jedoch keine Details zur genauen Ausgestaltung dieses Schrittes.

Es bestand daher ein Bedarf an weiteren Verbesserungen in der fermentativen Herstellung von Aminobenzoesäure bzw. Aminobenzoesäurederivaten, und zwar insbesondere bei dem Schritt der Isolierung der Aminobenzoesäure aus der Fermentationsbrühe.

Diesem Bedarf Rechnung tragend ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Aminobenzoesäure, insbesondere von ortho-Aminobenzoesäure, oder eines Aminobenzoesäurederivats, insbesondere eines Derivats des ortho-Isomers der Aminobenzoesäure, umfassend die Schritte:

Fermentation eines Rohstoffes, der wenigstens eine fermentierbare Kohlenstoff-haltige Verbindung umfasst und der bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Stärkehydrolysat, Zuckerrohrsaft und Zuckerrübensaft, unter Verwendung von Mikroorganismen, wobei eine

Aminobenzoat und/oder Aminobenzoesäure umfassende Fermentationsbrühe erhalten wird;

(Π) optionale Vorbehandlung der in Schritt (I) erhaltenen Fermentationsbrühe umfassend

(1) Abtrennung des Mikroorganismus aus der in Schritt (I) erhaltenen Fermentationsbrühe ohne pH-Wert-Anpassung, wobei eine an Mikroorganismen abgereicherte Fermentationsbrühe erhalten wird,

und/oder

(2) Entfärbung der in Schritt (I) erhaltenen Fermentationsbrühe oder, bei Durchführung von Schritt (II) (1), der in Schritt (II) (1) erhaltenen an Mikroorganismen abgereicherten Fermentationsbrühe, ohne pH-Wert- Anpassung;

einstufige Behandlung der in Schritt (I) oder Schritt (II) (1) oder Schritt (II) (2) erhaltenen Fermentationsbrühe in einem Reaktor mit Säure so, dass sich Aminobenzoesäure aus der Fermentationsbrühe abscheidet;

Isolierung der in Schritt (III) abgeschiedenen Aminobenzoesäure, wobei Mutterlauge zurückbleibt;

optionale weitere Reinigung der in Schritt (IV) gewonnenen Aminobenzoesäure, bevorzugt durch Waschen mit Wasser;

optionale weitere Umsetzung der in Schritt (IV) oder Schritt (V) erhaltenen Aminobenzoesäure zu einem Aminobenzosäurederivat;

wobei Schritt (III) so durchgeführt wird, dass Impfkristalle von Aminobenzoesäure zugegen sind.

Die Säurebehandlung in Schritt (III) ist dabei„ einstufig " in dem Sinne, dass der gewünschte Ziel-pH-Wert durch Säurezugabe direkt eingestellt wird, ohne dass bei pH-Werten zwischen dem Ausgangs-pH-Wert (d. i. der pH- Wert der in Schritt (I) oder Schritt (II) (1) oder Schritt (II) (2) erhaltenen Fermentationsbrühe, je nachdem, ob der optionale Schritt (II) durchgeführt wird und falls ja, aus welchen Teilschritten dieser besteht) und dem Ziel-pH- Wert (d. i. der pH- Wert, der sich nach beendeter Säurebehandlung in Schritt (III) einstellt) Zwischenschritte (wie Filtration, Zentrifugation, säulenchromatographische Behandlung und dgl.) durchgeführt werden. Die Einstellung des gewünschten Ziel-pH- Wertes durch die beschriebene einstufige Säurebehandlung erfolgt daher nur in Schritt (III) des erfindungsgemäßen Verfahrens. Die in Schritt (I) erhaltene Fermentationsbrühe wird also erfindungsgemäß entweder unmittelbar dem Schritt (III) unterworfen oder sie wird unmittelbar dem Schritt (II) unterworfen, und das Verfahrensprodukt des Schrittes (II) (d. h. das in Schritt (II) (1) oder Schritt (II) (2) erhaltene Verfahrensprodukt) wird dann unmittelbar dem Schritt (III) unterworfen.„ Unmittelbar " bedeutet dabei„ ohne Zwischenschritte ". Mit anderen Worten: Schritt (II) besteht aus Schritt (II) (1) und/oder Schritt (II) (2). Die Schritte (H) (1) und (H) (2) werden erfindungsgemäß „ohne pH-Wert-Anpassung", d. h. ohne Säurebehandlung, durchgeführt. Die Vielzahl der im Stand der Technik beschriebenen pH- Wert-

Anpassungen (Säurebehandlungen) wird im erfindungsgemäßen Verfahren daher auf eine einzige pH- Wert-Anpassung (Säurebehandlung) reduziert.

Als„Impfkristalle " im Sinne der vorliegenden Erfindung werden

(i) im Reaktor aus Schritt (III) vorgelegte Kristalle von Aminobenzoesäure (die auch aus einer externen Quelle stammen, z. B. zugekauft sein können) und/oder

(ii) im Reaktor aus Schritt (III) bei kontinuierlicher Durchführung dieses Schritts in situ gebildete Kristalle von Aminobenzoesäure, die als Impfkristalle für die Abscheidung weiterer Aminobenzoesäure dienen (sog. Sekundärkeimbildung), wie weiter unten noch näher erläutert wird,

aufgefasst.

Der Begriff„Aminobenzoesäurederivat" bezeichnet im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Produkt, das durch weitere chemische Umsetzung von Aminobenzoesäure erhalten wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht es, Aminobenzoesäure auf einfache Weise in hoher Reinheit zu gewinnen. In der Regel ist es nicht erforderlich, die gewonnene Aminobenzoesäure vor ihrer weiteren Verwendung umzukristallisieren; bevorzugt umfasst der Schritt (V), sofern durchgeführt, daher keine Urnkristallisation. Die im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens nach Schritt (IV) verbleibende Mutterlauge enthält Aminobenzoesäure nur in geringen, bevorzugt die thermodynamische Löslichkeit nicht überschreitenden Mengen. Hierdurch wird die Abwasserbelastung minimiert. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt ferner die Gewinnung von Aminobenzosäure in solchen Kristallgrößen, dass sich nach Abtrennung der Mutterlauge in Schritt (IV) bzw., wenn durchgeführt, nach Abtrennung des Waschwassers in Schritt (V), ein Restfeuchtigkeitsgehalt einstellt, der auch ohne aufwändige Trocknungsprozesse eine weitere Verwendung der Aminobenzoesäure ermöglicht.

Ausführungsformen der Erfindung werden nachfolgend näher beschreiben. Dabei können verschiedene Ausführungsformen beliebig miteinander kombiniert werden, sofern sich für den Fachmann aus dem Gesamtzusammenhang nicht das Gegenteil ergibt.

Schritt (I) des erfindungsgemäßen Verfahrens kann nach einer beliebigen aus dem Stand der Technik bekannten Verfahrensweise durchgeführt werden. Besonders bevorzugt sind Verfahren, wie sie in WO 2015/124686 AI und WO 2015/124687 AI unter Verwendung von Bakterien als

Mikroorganismen beschrieben sind. Dabei wird insbesondere auf WO 2015/124687 AI, (i) Seite 15, Zeile 8 bis Seite 16, Zeile 30, (ii) Beispiel 1 (Seite 29, Zeile 4 bis 26), (iii) Beispiel 3 (vor allem Seite 34, Zeile 10 bis 18), (iv) Beispiel 4 (vor allem Seite 55, Zeile 9 bis 31) verwiesen.

Es versteht sich von selbst, dass zur fermentativen Herstellung von Aminobenzoesäure neben einer Kohlenstoff- auch eine Stickstoffquelle erforderlich ist. Sofern die in Schritt (I) einzusetzende fermentierbare Kohlenstoff-haltige Verbindung nicht bereits eine geeignete Stickstoff-haltige Verbindung als Stickstoffquelle enthält, ist eine solche zuzusetzen. Bevorzugt wird zu diesem Zweck die Stickstoff-haltige Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ammoniakgas, Ammoniakwasser, Ammoniumsalzen (insbesondere Ammoniumsulfat und Ammoniumchlorid) und Harnstoff.

Bevorzugt umfassen die in Schritt (I) eingesetzten Mikroorganismen eine Art ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Escherichia coli, Pseudomonas putida und Corynebacterium glutamicum. Besonders bevorzugt bestehen die Mikroorganismen nur aus Vertretern genau einer dieser Arten. Corynebacterium glutamicum ATTC 13032 ist dabei insbesondere bevorzugt.

Der in der Fermentation einzuhaltende pH- Wert richtet sich nach dem eingesetzten Mikroorganismus. Die Fermentation in Schritt (I) wird insbesondere bei einem solchen pH- Wert durchgeführt, dass eine spontane Abscheidung von Aminobenzoesäure bereits in der Fermentationsbrühe weitgehend bis vollständig vermieden wird, d. h. Schritt (I) wird insbesondere bei einem pH-Wert von > 6,5 durchgeführt. Mikroorganismen wie Corynebacterium glutamicum, Pseudomonas putida oder Escherichia coli werden bevorzugt bei im Wesentlichen neutralen pH-Werten (d. h. bevorzugt bei einem pH- Wert im Bereich von 6,5 bis 8,0) kultiviert.

In jedem Fall wird der Mikroorgansimus aus Schritt (I) bevorzugt so ausgewählt, dass in der Fermentation (selektiv) das ortho-Isomer von Aminobenzoesäure und/oder Aminobenzoat gebildet wird. „Selektiv " bedeutet dabei, dass andere Isomere nicht oder allenfalls in untergeordneten Anteilen (d. h. in Anteilen - wie bestimmt per Hochleistungsflüssigchromatographie, HPLC - von insgesamt maximal 0,50 %, bevorzugt maximal 0,25 %, ganz besonders bevorzugt maximal 0,10 %, außerordentlich ganz bevorzugt maximal 0,05 %, jeweils bezogen auf die Gesamtheit aller Aminobenzoesäure-Isomeren) gebildet werden. Hierzu eignen sich insbesondere Mikroorganismen einer Art ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Escherichia coli, Pseudomonas putida und Corynebacterium glutamicum.

Um ein geeignetes Bakterium zu erhalten, stehen grundsätzlich zwei Wege zur Verfügung, die in bevorzugter Ausgestaltung auch kombiniert werden können:

(i) Die enzymatischen Reaktionen im Aminobenzoesäure-Stoffwechselweg der Bakterienzelle können so erhöht werden, dass Aminobenzoesäure schneller produziert als verbraucht wird.

(ii) Die Folgereaktionen, durch welche Aminobenzoesäure in weitere Metaboliten oder Produkte (z. B. Tryptophan) überführt wird, können reduziert bzw. ausgeschaltet werden, sodass sogar die Geschwindigkeit der Aminobenzoesäure-Bildung in Wildtyp-Stämmen ausreichend ist, um zu einer Anreicherung von Aminobenzoesäure in der Zelle zu führen.

Verfahren zur Gewinnung von Bakterien mit den zuvor genannten Eigenschaften sind im Stand der Technik bekannt. Geeignete Bakterien können beispielsweise durch Screening nach Mutanten, welche Aminobenzoesäure in das umgebende Medium abgeben, identifiziert werden. Die zielgerichtete Modifikation von Schlüsselenzymen mittels gentechnischer Verfahren ist jedoch bevorzugt. Mit üblichen gentechnischen Methoden können Genexpression und Enzymaktivität nach Belieben verstärkt, verringert oder sogar ganz unterbunden werden. Es resultieren rekombinante Stämme.

Besonders bevorzugt enthalten die in Schritt (I) einzusetzenden Bakterien eine Modifizierung der Anthranilat-Phosphoribosyltransferase-Aktivität, welche besagte Enzymaktivität herabsetzt. Durch diese Modifizierung wird die Umwandlung von Ortho- Aminobenzoat zu N-(5-Phospho-D-Ribosyl)-Anthranilat reduziert oder komplett unterbunden. Hierdurch wird eine Anreicherung von Aminobenzoesäure in der Zelle bewirkt. Die Bezeichnung„Anthranilat-Phosphoribosyltransferase-Aktivität" bezieht dabei sich auf eine Enzymaktivität, durch welche die Umsetzung von ortho-Aminobenzoat zu N-(5-Phospho-D-Ribosyl)-Anthranilat katalysiert wird.

In dem Bakterium Corynebacterium glutamicum wird die Anthranilat-Phosphoribosyltransferase-Aktivität durch das trpD Gen (cg3361, Cgl3032, NCgl2929) kodiert. Im Falle von Pseudomonas putida erfolgt die Kodierung über das trpD Gen (PP 0421) innerhalb des trpDC Operons.

Die beschriebene Herabsetzung der Anthranilat-Phosphoribosyltransferase-Aktivität kann prinzipiell auf drei Wegen erreicht werden:

(i) Die Regulierung der Expression des Gens für die Anthranilat- Phosphoribosyltransferase-Aktivität kann so modifiziert werden, dass die Transkription des Gens oder anschließende Translation verringert oder unterbunden wird.

Die Nukleinsäuresequenz des Gens für Anthranilat-Phosphoribosyltransferase- Aktivität kann so modifiziert werden, dass das Enzym, welches durch das modifizierte Gen kodiert wird, eine geringere spezifische Aktivität aufweist.

(iii) Das native Gen für Anthranilat-Phosphoribosyltransferase-Aktivität kann durch ein anderes Gen, das von einem verschiedenen Organismus stammt, ersetzt und ein Enzym mit einer spezifischen Anthranilat-Phosphoribosyltransferase- Aktivität, die geringer ist als die der zuvor erwähnten nativen Gene (z.B. trpD oder trpDC), kodiert werden.

Unabhängig davon, welcher Mikroorganismus eingesetzt wird, umfasst die Fermentationsbrühe zu Beginn der Fermentation in Schritt (I) rekombinante Zellen des eingesetzten Mikroorganismus und mindestens eine fermentierbare Kohlenstoff-haltige Verbindung (sowie mindestens eine Stickstoffhaltige Verbindung als Stickstoffquelle, entweder als Bestandteil der Kohlenstoff-haltigen Verbindung oder zugesetzt). Bevorzugt enthält die Fermentationsbrühe darüber hinaus noch weitere Bestandteile ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Puffersystemen, anorganischen Nährstoffen, Aminosäuren, Vitaminen und weiteren organischen Verbindungen welche für das Wachstum bzw. den Erhaltungsstoffwechsel der rekombinanten Zellen benötigt werden. Die Fermentationsbrühe ist wasserbasiert. Nach Einsetzen des Fermentationsprozesses umfasst die Fermentationsbrühe auch Aminobenzoesäure und/oder Aminobenzoat (abhängig vom pH- Wert, bei dem die Fermentation durchgeführt wird), das angestrebte Fermentationsprodukt.

Unter einer fermentierbaren Kohlenstoff-haltigen Verbindung im Sinne der vorliegenden Erfindung wird jede organische Verbindung oder Mischung organischer Verbindungen verstanden, die von den rekombinanten Zellen des eingesetzten Mikroorganismus verwendet werden kann, um Aminobenzoesäure zu produzieren. Die Produktion von Aminobenzoesäure kann dabei in Gegenwart oder Abwesenheit von Sauerstoff stattfinden.

Bevorzugt sind dabei solche fermentierbaren Kohlenstoff-haltigen Verbindungen, die zusätzlich als Energie- und Kohlenstoffquelle für das Wachstum der rekombinanten Zellen des eingesetzten Mikroorganismus dienen können. Besonders geeignet sind Stärkehydrolysat, Zuckerrohrsaft, Zuckerrübensaft und Hydrolysate aus lignocellulosehaltigen Rohstoffen. Ebenfalls geeignet sind Glycerin und C 1 -Verbindungen, insbesondere Kohlenstoffmonoxid.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird Schritt (I) kontinuierlich durchgeführt, d. h. dass die Edukte dem Fermentationsreaktor kontinuierlich zugeführt und das Produkt dem Fermentationsreaktor kontinuierlich entnommen wird. In kontinuierlicher Verfahrensführung wird der Mikroorganismus unter Umständen mit dem Produktstrom ausgetragen; der Mikroorganismus reproduziert sich jedoch im Allgemeinen selbst, sodass eine Zuführung von frischem Mikroorganismus in der Regel nicht nötig ist (erforderlichenfalls aber natürlich vorgenommen werden kann). Eine Zellrückhaltung zur Vermeidung der Austragung von Mikroorganismus ist ebenfalls möglich.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird Schritt (I) in einer diskontinuierlichen Verfahrensführung (sog. „Batch-Fahrweise") durchgeführt. In einer Variante der diskontinuierlichen Fahrweise (sog. „ ei -Batch-Fahrweise") werden die Edukte dem Fermentationsreaktor so lange kontinuierlich oder in Intervallen, bevorzugt kontinuierlich, zugeführt, wie es das Reaktorvolumen erlaubt, ohne dass Produkte dem Reaktor entnommen werden. Die Reaktion wird nach Zugabe der maximal möglichen Menge an Edukten unterbrochen und das Produktgemisch dem Fermentationsreaktor entnommen.

Unabhängig von der genauen Fahrweise umfasst der Reaktionsapparat, in welchem Schritt (I) durchgeführt wird (im Folgenden Fermentationsreaktor), bevorzugt Einrichtungen zur Messungen wichtiger Prozessparameter wie Temperatur, pH- Wert der Fermentationsbrühe, Konzentration an Substrat und Produkt, Gehalt an gelöstem Sauerstoff, Zelldichte der Fermentationsbrühe. Insbesondere bevorzugt umfasst der Fermentationsreaktor Einrichtungen zur Anpassung von mindestens einem (bevorzugt von allen) der vorgenannten Prozessparameter.

Geeignete Fermentationsreaktoren sind Rührkessel, Membranreaktoren, Kolbenstromreaktoren („plug flow reactors") oder Schlaufenreaktoren (siehe beispielsweise Bioprozesstechnik, Horst Chmiel, ISBN-10: 3827424763, Spektrum Akademischer Verlag). Besonders bevorzugt sowohl für aerobe als auch für anaerobe Fermentationen sind Rührkesselreaktoren und Schlaufenreaktoren (insbesondere Airliftreaktoren, in denen die Zirkulation der Flüssigkeit im Reaktor durch Begasung erreicht wird).

Der optionale Schritt (II) (1), die Abtrennung des Mikroorganismus aus der Fermentationsbrühe, ist an sich aus dem Stand der Technik bekannt und erfolgt im Rahmen der vorliegenden Erfindung insbesondere durch Filtration oder Zentrifugation. Bevorzugt wird dieser Schritt, sofern er erfolgt, durchgeführt wie in WO 2015/124686 AI und WO 2015/124687 AI beschrieben. Dabei wird insbesondere auf WO 2015/124687 AI, Seite 15, Zeile 8 bis Seite 15, Zeile 17, verwiesen.

Der optionale Schritt (II) (2), der sich, wenn durchgeführt, entweder an Schritt (I) oder an Schritt (II) (2) anschließt, wird bevorzugt so durchgeführt, dass Fermentationsbrühe bzw. an Mikroorganismen abgereicherte Fermentationsbrühe über eine Säule mit fester Packung geleitet wird, um Farbstoffe mittels Adsorption zu entfernen. Als mögliche feste Phase kann z. B. Kieselgur oder Ionenaustauscherpackungen verwendet werden. Schritt (II) (2) wird bevorzugt dann durchgeführt, wenn in der Fermentationsbrühe aus Schritt (I) oder (II) (1) solche farbigen Substanzen vorhanden sind, die die nachfolgende Kristallisation stören könnten.

In Schritt (III) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird durch Säurezugabe zur Fermentationsbrühe der pH- Wert so eingestellt, dass Aminobenzoesäure auskristallisiert. Diese Art der Kristallisation wird auch als Reafez'vkristallisation bezeichnet. Dies geschieht bevorzugt derart, dass der pH-Wert der resultierenden Mischung dem des isoelektrischen Punkts des abzuscheidenden Isomers von Aminobenzoesäure entspricht oder diesem zumindest nahekommt. Im Falle von ortho-Aminobenzoesäure als gewünschtem Produkt wird daher der pH-Wert bevorzugt auf einen Wert im Bereich von 3,0 bis 4,7, besonders bevorzugt auf einen Wert im Bereich von 3,2 bis 3,7, ganz besonders bevorzugt auf einen Wert im Bereich von 3,4 bis 3,6, eingestellt, also nahe oder entsprechend dem isoelektrischen Punkt bei pH 3,5. Dieser isoelektrische Punkt liegt für die beiden anderen Isomere von Aminobenzoesäure jeweils bei etwa pH 3,7.

Als Säure kommen alle Säuren in Betracht, mit denen ein pH- Wert, der dem isolektrischen Punkt des gewünschten Aminobenzoesäure-Isomers entspricht oder zumindest nahekommt, eingestellt werden kann. Bevorzugt werden hierzu starke Mineralsäuren, insbesondere Salzsäure, Schwefelsäure und/oder Phosphorsäure eingesetzt. Bevorzugt umfasst die in Schritt (III) eingesetzte Säure Salzsäure, besonders bevorzugt Salzsäure einer Konzentration von 15 Massen-% bis 37 Massen-%, ganz besonders bevorzugt Salzsäure einer Konzentration von 18 Massen-%> bis 25 Massen-%). Es ist insbesondere bevorzugt, dass die Säure neben dieser Salzsäure mit Ausnahme von optional zugesetzter rezyklierter Mutterlauge aus Schritt (IV) keine weitere Säure umfasst (d. h. es wird keine weitere Säure aus einer externen Quelle zugegeben). Wenn als in Schritt (III) eingesetzte Säure eine Mischung aus Salzsäure und einem Teil der in Schritt (IV) erhaltenen Mutterlauge eingesetzt wird, so werden bevorzugt 1,0 Massen-%> bis 50 Massen-%> der in Schritt (IV) insgesamt erhaltenen Mutterlauge mit Salzsäure vermischt.

Als Reaktor in Schritt (III) kommen dem Fachmann geläufige übliche Ausgestaltungen chemischer Reaktoren in Betracht. Beispielhaft seien Rührkessel oder Zwangsumlaufkristallisatoren wie solche vom„Typ Oslo" genannt. Mögliche Reaktoren für Schritt (III) (auch„Kristaller" genannt) sind in den beigefügten Zeichnungen dargestellt:

FIG. 1 zeigt einen Kristaller mit Zwangsumlaufkristallisation ohne Einbauten. Es bedeuten: (1) Mögliche Zufuhreinrichtungen für Fermentationsbrühe bzw. Säure, (2) Pumpe bzw. Crusher, (3) Wärmeaustauscher, (4) Fest-Flüssigtrennung (z. B. Filtration).

FIG. 2 zeigt einen Kristaller mit Zwangsumlaufkristallisation und Einbauten, wobei der Umpumpkreislauf seitlich des Sichters eingesetzt wird. Es bedeuten: (1) Mögliche Zufuhreinrichtungen für Fermentationsbrühe bzw. Säure, (2) Pumpe bzw. Crusher, (3) Wärmetauscher, (4) Fest-Flüssigtrennung (z. B. Filtration), (5) Sichter, (6) Beruhigungszone.

FIG. 3 zeigt einen Kristaller mit Zwangsumlaufkristallisation und Einbauten, wobei der Umpumpkreislauf am Sichterboden zur Aufwirbelung eingesetzt wird. Es bedeuten: (1) Mögliche Zufuhreinrichtungen für Fermentationsbrühe bzw. Säure, (2) Pumpe bzw. Crusher, (3) Wärmetauscher, (4) Fest-Flüssigtrennung (z. B. Filtration), (5) Sichter, (6) Beruhigungszone.

Es hat sich bewährt, in Schritt (III) die Fermentationsbrühe und die Säure dem Reaktor über räumlich (möglichst weit) getrennte Zuführeinrichtungen zuzuführen. Hierdurch wird erreicht, dass die Reaktanden möglichst gut mit dem Reaktorinhalt vermischt werden, bevor es zur Säure-Base-Reaktion kommt (vgl. z. B. Beckmann, Crystallization, Wiley 2013, S. 175 bis 176). Als Zuführeinrichtungen kommen bspw. Rohrleitungen, bevorzugt mit Absperrventilen, in Betracht. In einer Ausführungsform sind die Zuführeinrichtung für die Fermentationsbrühe und die Zuführeinrichtung für die Säure an gegenüberliegenden Stellen der Reaktorwandung (im Wesentlichen) rechtwinklig zu dieser angeordnet. In einer anderen Ausführungsform sind die Zuführeinrichtung für die Fermentationsbrühe und die Zuführeinrichtung für die Säure (im Wesentlichen) parallel zur Reaktorwandung angeordnet, wobei sich die Zuführeinrichtungen gegenüberliegen und möglichst nahe, insbesondere unmittelbar, an der Reaktorwand befinden.

Es ist möglich, den in Schritt (III) eingesetzten Reaktor durch geeignete Einbauten in Kammern zu unterteilen. Mögliche resultierende Kammern sind die in FIG. 2 und FIG. 3 dargestellten Beruhigungszonen (6) oder Sichter (5). Durch Wahl von Rührergeometrie und Rührerbetriebsweise kann die Strömungsrichtung eingestellt werden. Es ist ebenfalls möglich, den Reaktor mit einem externen Umpumpkreislauf zu versehen, wobei dann einer der beiden Reaktanden -Fermentationsbrühe oder Säure - in den Umpumpkreislauf und der andere direkt in den Reaktor gegeben wird (vgl. die Zeichnungen). Wird ein Reaktor mit Sichter und Umpumpkreislauf betrieben, wird der Umpumkreislauf am Sichterboden zur Aufwirbelung oder seitlich des Sichters eingesetzt.

Es hat sich ferner bewährt, in Schritt (III) bei kontinuierlicher Durchführung dieses Schritts

die Säure mit einer solchen Dosiergeschwindigkeit und

die Fermentationsbrühe mit einer solchen Dosiergeschwindigkeit

dem Reaktor zuzuführen und eine Suspension von Produkt (also in sauer gestellter Fermentationsbrühe [= Mutterlauge] suspendierte Aminobenzoesäure) dem Reaktor absatzweise oder kontinuierlich, bevorzugt kontinuierlich, so zu entnehmen, dass sich eine Verweilzeit der Suspension im Reaktor von % h bis 10 h, bevorzugt von % h bis 2 h, ergibt. Unter einer kontinuierlichen Durchführung des Schrittes (III) wird im Sinne der vorliegenden Erfindung eine Fahrweise verstanden, bei der dem Reaktor aus Schritt (III) Säure und Fermentationsbrühe kontinuierlich zugeführt und Produkt (also in sauer gestellter Fermentationsbrühe [= Mutterlauge] suspendierte Aminobenzoesäure) dem Reaktor zumindest absatzweise (semi-kontinuierliche Fahrweise) oder bevorzugt ebenfalls kontinuierlich (vollkontinuierliche Fahrweise) entnommen wird.

Bei einer diskontinuierlichen Durchführung von Schritt (III) ist es bevorzugt, die Säurebehandlung in Schritt (III) über einen Zeitraum von % h bis 1 Oh, bevorzugt von % h bis 2 h, durchzuführen. Unter einer diskontinuierlichen Durchführung des Schrittes (III) wird im Sinne der vorliegenden Erfindung eine Fahrweise verstanden, bei der alle Reaktanden dem Reaktor zugeführt und dort für einen gewünschten Zeitraum zur Reaktion gebracht werden. Nach Beendigung des Schrittes (III) wird dann die abgeschiedene Aminobenzoesäure aus dem erhaltenen Reaktionsgemisch isoliert (Schritt (IV); siehe unten für Details). Die Gewinnung der Aminobenzoesäure erfolgt also in dieser Ausführungsform chargenweise.

Unabhängig von der Fahrweise (kontinuierlich oder diskontinuierlich) werden die genauen Betriebsparameter (u. a.) durch die gewünschte Kristallgröße bestimmt, welche durch die Verweilzeit/Reaktionszeit und den Übersättigungsgrad eingestellt werden kann (große Kristallgrößen werden durch lange Verweilzeiten/lange Reaktionszeiten und geringe Übersättigungsgrade begünstigt).

Die Anwesenheit von Impfkristallen von Aminobenzoesäure während der Säurebehandlung von Schritt (III) kann wie folgt realisiert werden:

In einer Ausführungsform der Erfindung wird die Anwesenheit von Impfkristallen von Aminobenzoesäure in Schritt (III) dadurch erreicht, dass die Fermentationsbrühe und die Säure zu einer im Reaktor vorgelegten Suspension an Impfkristallen gegeben werden. Diese Impfkristalle können aus einer früheren Produktionscharge oder einer externen Quelle stammen. Diese Ausführungsform eignet sich insbesondere dann, wenn Schritt (III) diskontinuierlich durchgeführt wird. Sie kann aber auch bei der Inbetriebnahme einer kontinuierlich durchgeführten Abscheidung von Aminobenzoesäure in Schritt (III) des erfindungsgemäßen Verfahrens angewandt werden. Bevorzugt wird in beiden Fällen als Suspension eine Suspension der Impfkristalle in einem Teil der in Schritt (I) oder Schritt (II) (1) oder Schritt (II) (2) erhaltenen Fermentationsbrühe eingesetzt, wobei die Impfkristalle bevorzugt in 1,0 Massen-% bis 20 Massen-% der in Schritt (III) insgesamt eingesetzten Fermentationsbrühe suspendiert werden.

Bevorzugt wird Schritt (III) des erfindungsgemäßen Verfahrens kontinuierlich, wie zuvor definiert, durchgeführt. In dieser Ausführungsform es ist bevorzugt, zur Inbetriebnahme der kontinuierlich durchgeführten Abscheidung von Aminobenzoesäure durch Säurebehandlung in Schritt (III) des erfindungsgemäßen Verfahrens im Reaktor eine Suspension an Impfkristallen vorzulegen, zu welcher dann die Fermentationsbrühe und die Säure kontinuierlich zugegeben werden. Daraufhin

beginnt Ammobenzoesäure sich abzuscheiden, wobei der pH-Wert als Stellgröße für die Abscheidungsgeschwindigkeit dienen kann. Sobald die Abscheidung von Ammobenzoesäure im Reaktor aus Schritt (III) begonnen hat, wirken die in situ abgeschiedenen Kristalle der Ammobenzoesäure als Impfkristalle für die Abscheidung weiterer Ammobenzoesäure. In dieser Ausführungsform der Erfindung wird die Anwesenheit von Impfkristallen - neben den ggf. zur Inbetriebnahme vorgelegten Impfkristallen - von Ammobenzoesäure in Schritt (III) also bevorzugt dadurch erreicht, dass Fermentationsbrühe und Säure kontinuierlich dem Reaktor zugeführt werden und eine Suspension von Ammobenzoesäure dem Reaktor absatzweise oder kontinuierlich, bevorzugt kontinuierlich, entnommen wird, wobei die Zufuhr an Fermentationsbrühe und Säure sowie die Entnahme an Suspension so eingestellt werden, dass in dem im Reaktor befindlichen Teil der Reaktionsmischung (also in dem Teil der Reaktionsmischung, der nicht gerade entnommen wird) stets Kristalle von Ammobenzoesäure, die als Impfkristalle wirken, vorhanden sind. Bevorzugt werden die Zufuhr an Fermentationsbrühe und Säure sowie die Entnahme an Suspension so eingestellt, dass die Menge an in einem Zeitraum über die ausgetragene Suspension entnommener Ammobenzoesäure der Menge an im selben Zeitraum neu abgeschiedener Ammobenzoesäure entspricht. Die für eine kontinuierliche Verfahrensweise erforderliche kontinuierliche Erzeugung von Kristallisationskeimen durch Sekundärkeimbildung kann durch jede der bekannten, dem Fachmann geläufigen Methoden erfolgen; z B. durch Stöße mit einem Rührorgan oder durch Umpumpen (vgl. auch Beckmann, Crystallization, Wiley 2013, S. 203 bis 233). Die Details hängen von der tatsächlichen Ausführung des Reaktors aus Schritt (III) (des „Kristallers") und der gewünschten Kristallgröße ab; ggf. ist eine Klassierung erforderlich. Eine Klassierung kann mit Hilfe eines Sichters oder Hydrozyklons erfolgen. Bei kontinuierlicher Verfahrensführung ist das Vorlegen von Impfkristallen aus einer externen Quelle - zugekauft oder aus einer früheren Produktionscharge - also allenfalls bei der Inbetriebnahme erforderlich; es ist nicht nötig und nicht bevorzugt, während der kontinuierlich durchgeführten Abscheidung der Ammobenzoesäure permanent Impfkristalle aus einer solchen externen Quelle zuzuführen. Wird auf das Vorlegen von Impfkristallen zur Inbetriebnahme verzichtet, erhöht sich der Zeitbedarf bis zum Erreichen eines stationären Betriebszustandes; auch kann die Stabilität des Betriebes nachteilig beeinflusst werden. Obwohl nicht bevorzugt, ist eine solche Verfahrensführung jedoch nicht ausgeschlossen.

Unabhängig von der gewählten Ausführungsform wird der Anteil an in Suspension vorgelegten Impfkristallen, sofern vorhanden, in Schritt (III) im erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt auf einen Wert von 0,50 Massen-% bis 30 Massen-%, bezogen auf die Gesamtmasse der in Schritt (III) abzuscheidenden Ammobenzoesäure, eingestellt. Dies gilt für alle Isomere der Ammobenzoesäure. Als Gesamtmasse der in Schritt (III) abzuscheidenden Ammobenzoesäure wird für diesen Zweck

vereinfachend die Masse der Aminobenzoesäure bei 100%iger Abscheidung zugrunde gelegt. Diese ergibt sich in einfacher Weise aus den bekannten Einsatzkonzentrationen und -mengen.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird bevorzugt zur Herstellung von ortho-Aminobenzoesäure oder eines entsprechenden Aminobenzoesäurederivats eingesetzt. Es ist insbesondere bevorzugt, dass die in der Suspension in Schritt (III) vorgelegten Impfkristalle, sofern vorhanden, zu mindestens 90 %, bevorzugt zu mindestens 95 %, bezogen auf die Gesamtmasse aller in der Suspension vorgelegten Impfkristalle, aus der Modifikation Form I bestehen, gemäß der in Ojala, W. FL; Etter, M. C, J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 10288 - 10293 beschriebenen Nomenklatur. Hierdurch wird eine bevorzugte Kristallisation dieser Modifikation bewirkt, was eine Ausbeuteerhöhung zur Folge hat.

Schritt (IV), die Isolierung der in Schritt (III) abgeschiedenen Aminobenzoesäure, ist an sich aus dem Stand der Technik bekannt und erfolgt erfindungsgemäß bevorzugt durch Filtration oder Zentrifugation. Bevorzugt wird dieser Schritt durchgeführt wie in WO 2015/124687 AI beschrieben. Dabei wird insbesondere auf WO 2015/124687 AI, Seite 17, Zeile 13 bis Seite 17, Zeile 16, verwiesen. Die Filtration kann bei vermindertem Druck, Umgebungsdruck oder erhöhtem Druck durchgeführt werden. Bei kontinuierlicher Durchführung von Schritt (III) wird auch Schritt (IV) bevorzugt kontinuierlich durchgeführt, d. h. die in Schritt (III) absatzweise oder kontinuierlich entnommene Suspension wird direkt im Anschluss an Schritt (III) absatzweise oder kontinuierlich isoliert.

Der optionale Schritt (V), die weitere Reinigung der in Schritt (IV) gewonnenen Aminobenzoesäure, ist an sich aus dem Stand der Technik bekannt (siehe vor allem WO 2015/124687 AI und insbesondere auf WO 2015/124687 AI, Seite 18, Zeile 4 bis Seite 18, Zeile 6) und erfolgt erfindungsgemäß bevorzugt durch eine oder mehrere Wäschen mit wässrigen Waschmedien, insbesondere Wasser. Um Ausbeuteverluste zu vermeiden, kann der pH- Wert des wässrigen Waschmediums auf den gleichen Wert wie in Schritt (III) nach beendeter Säurezugabe eingestellt werden; es wird also in dieser Ausführungsform statt mit Wasser mit einer verdünnten Säure, insbesondere der gleichen Säure wie in Schritt (III) eingesetzt, gewaschen. Das nach Entfernung des wässrigen Waschmediums durch Filtration, ggf. unterstützt durch Anlegen eines erniedrigten oder erhöhten Drucks, zurückbleibende Produkt weist im Allgemeinen, infolge großer Kristallgrößen, eine so geringe Restfeuchte auf, dass auf aufwändige weitere Trocknungsschritte vor der weiteren Verwendung verzichtet werden kann. Wird auf Schritt (V) verzichtet, gilt das Gleiche für das nach Schritt (IV) erhaltene Produkt.

Die erfindungsgemäß gewonnene Aminobenzoesäure wird bevorzugt zu einem Aminobenzoesäurederivat weiter umgesetzt, d. h. Schritt (VI) wird bevorzugt durchgeführt. Ausgewählte weitere Umsetzungen der erhaltenen Aminobenzoesäure in Schritt (VI) sind:

(VI-1) Decarboxlierung zu Anilin;

(VI-2) Decarboxylierung gefolgt von säurekatalysierter Reaktion mit Formaldehyd unter Bildung von Di- und Polyaminen der Diphenylmethanreihe;

(VI-3) Decarboxylierung gefolgt von säurekatalysierter Reaktion mit Formaldehyd, gefolgt von Umsetzung mit Phosgen unter Bildung von Di- und Polyisocyanaten der Diphenylmethanreihe;

(VI-4) Umsetzung zu einer Azoverbindung, insbesondere zu einem Azo-Farbstoff;

(VI-5) Umsetzung zu Amiden;

(VI-6) Umsetzung zu leitenden Polymeren wie insbesondere Polyanthranilsäure.

Die Decarboxylierung von Aminobenzoesäure, insbesondere des ortho-Isomers, zu Anilin (VI-1) ist an sich bekannt und kann im Rahmen der vorliegenden Erfindung genauso durchgeführt werden wie in der Literatur beschrieben. Geeignete Verfahrensweisen sind beispielsweise in WO 2015/124686 AI und WO 2015/124687 AI beschreiben. Die Decarboxylierung wird bevorzugt bei einer Temperatur im Bereich 150 °C bis 250 °C, besonders bevorzugt im Bereich von 160 °C bis 220 °C, ganz besonders bevorzugt im Bereich von 180 °C bis 200 °C, durchgeführt. Die Decarboxylierung kann rein thermisch bewirkt, aber auch katalytisch betrieben werden. Als Katalysatoren eignen sich bspw. Zeolithe.

Die weitere Umsetzung des so erhaltenen Anilins mit Formaldehyd zu Di- und Polyaminen der Diphenylmethanreihe (VI-2) ist ebenfalls an sich bekannt und kann nach einem beliebigen Verfahren des Standes der Technik durchgeführt werden. Die kontinuierliche oder teilweise diskontinuierliche Herstellung von Di- und Polyaminen der Diphenylmethanreihe aus Anilin und Formaldehyd ist z. B. in EP 1 616 890 AI, US-A-5286760, EP-A-451442 und WO-A-99/40059 offenbart. Die Reaktion erfolgt unter Säurekatalyse. Als saurer Katalysator eignet sich vorzugsweise Salzsäure.

Die weitere Umsetzung der so erhaltenen Di- und Polyamine der Diphenylmethanreihe mit Phosgen zu Di- und Polyisocyanaten der Diphenylmethanreihe (VI-3) ist ebenfalls an sich bekannt und kann nach einem beliebigen Verfahren des Standes der Technik durchgeführt werden.

Geeignete Verfahren sind beispielsweise in EP 2 077 150 Bl, EP 1 616 857 AI, EP 1 873 142 AI, und EP 0 314 985 Bl beschrieben.

Die Umsetzung der erfindungsgemäß erhaltenen Aminobenzoesäure zu Azoverbindungen, insbesondere zu Azo-Farbstoffen (VI-4) kann nach einem beliebigen Verfahren des Standes der Technik erfolgen. Beispielhaft sei auf die bekannte Herstellung von Methylrot oder Indigo verwiesen (Per Wiklund et al, Current Organic Synthesis, 2006, 3, 379 - 402).

Die Umsetzung der erfindungsgemäß erhaltenen Aminobenzoesäure zu Amiden (VI-5) kann ebenfalls nach einem beliebigen Verfahren des Standes der Technik erfolgen. Beispielhaft sei das primäre Amin von Anthranilsäure (2-Aminobenzylamid) erwähnt, welches unter anderem als Startmaterial für die Herstellung von Pharmazeutika verwandt wird (Per Wiklund et al, Current Organic Synthesis, 2006, 3, 379 - 402).

Die Umsetzung zu leitenden Polymeren wie insbesondere Polyanthranilsäure ist beispielsweise beschrieben in Bhavana Guptaa et al., Polymers Advanced Technologies, 2011, 22, 1982- 1988.

Beispiele

In allen Beispielen wurde die jeweils eingesetzte Fermentationsbrühe hergestellt durch Fermentation von rekombinanten Corynebacterium-glutamicum-ATTC-\3032-StämmQn, die eine Deletion bzw. reduzierte Expression des trpD Gens aufweisen, welches für die Anthranilat-Phosphoribosyltransferase kodiert - wie in WO 2015/124687 AI, insbesondere auf S. 6, Z. 8 bis 28 und Beispiel 3 beschrieben (entspricht Schritt (I) des erfindungsgemäßen Verfahrens). Zur Abreicherung des eingesetzten Mikroorganismus wurde die Fermentationsbrühe filtriert (Schritt (II) des erfindungsgemäßen Verfahrens).

Beispiel 1 ( ergleich: diskontinuierliche Durchführung der Säurebehandlung - Zugabe von Salzsäure zu vorgelegter Fermentationsbrühe ohne Impfkristalle)

100 g einer Fermentationsbrühe mit einem Gehalt an Ortho- Aminobenzoesäure von 91 g/L und einen pH- Wert von 6,9 wurden in einem Planschliffkessel vorgelegt und über 1 h mit Salzsäure mit einem Massenanteil von 10 % auf einen pH-Wert von 3,6 eingestellt. Hierzu waren 29,2 g der Salzsäure erforderlich, was einem Äquivalenzverhältnis von 1,1 entspricht (entspricht bis auf die fehlenden Impfkristalle Schritt (III) des erfindungsgemäßen Verfahrens).

Nach einer Nachrührzeit von 1 h wurde das Kristallisat durch Filtration isoliert (Schritt (IV) des erfindungsgemäßen Verfahrens) und mit Wasser gewaschen (Schritt (V) des erfindungsgemäßen Verfahrens).

Der Filterwiderstand lag bei α = 5,3 10+1° 1/m2, die Restfeuchte im Kuchen lag bei 30,7 % und die isolierte Ausbeute betrug 88 %. Die Kristallgröße wurde anhand von mikroskopischen Bildern zu 200 μιη abgeschätzt.

Das Kristallisat lag in der Modifikation II vor, was aufgrund von dessen im Vergleich zur Modifikation I höheren Löslichkeit nachteilig ist. Der Gehalt des Kristallisats an Ortho- Aminobenzoesäure lag bei 93 %.

Beispiel 2 (Vergleich: diskontinuierliche Durchführung der Säurebehandlung - Zugabe von

Salzsäure zu vorgelegter Fermentationsbrühe ohne Impfkristalle)

In einer Variation von Beispiel 1 wurde eine 37%-ige Salzsäure eingesetzt.

Der Filterwiderstand wurde zu α = 5,0 10 1/m2 bestimmt, die Restfeuchte im Kuchen lag bei 61 % und die isolierte Ausbeute betrug 85 %. Die Kristallgröße wurde anhand von mikroskopischen Bildern zu 100 μιη abgeschätzt.

Das Kristallisat lag in der Modifikation II vor. Der Gehalt des Kristallisats an ortho- Aminobenzoesäure lag bei 94 %, der Aschegehalt betrug 0,55 %.

Beispiel 3 (Vergleich diskontinuierliche Durchführung der Säurebehandlung - Zugabe von Salzsäure zu vorgelegter Fermentationsbrühe ohne Impfkristalle)

In einer anderen Variation von Beispiel 1 erfolgte der Zusatz der Salzsäure über 5 min.

Der Filterwiderstand wurde zu α = 4,9 10+1° 1/m2 bestimmt, die Restfeuchte im Kuchen lag bei 46,7 % und die isolierte Ausbeute betrug 93 %. Die Kristallgröße wurde anhand von mikroskopischen Bildern zu 150 μιη abgeschätzt.

Das Kristallisat lag in der Modifikation II vor.

Beispiel 4 (erfindungsgemäß: diskontinuierliche Durchführung der Säurebehandlung kontinuierliche Zuführung von Salzsäure und Fermentationsbrühe zu einer Suspension an Impfkristallen)

Im sog. Fed-Batch- Verfahren wurden Salzsäure und Fermentationsbrühe kontinuierlich zu einer vorgelegten Suspension von Impfkristallen der Modifikation I in Fermentationsbrühe mit einem pH- Wert von 3,5 dosiert. Die Fermentationsbrühe (sowohl die vorgelegte als auch die zugeführte) hatte einen Gehalt an ortho- Aminobenzoesäure von 91 g/L, die Salzsäure hatte einen Massengehalt von 17 %. Die Dosierung wurde über 2 h durchgeführt, wobei der pH- Wert zwischen 2,3 (kurzzeitig zu Beginn der Dosierung) und 3,5 (über die gesamte restliche Dosierzeit) lag (Schritt (III) des erfindungsgemäßen Verfahrens).

Nach einer Nachrührzeit von 1 h wurde das Kristallisat durch Filtration isoliert (Schritt (IV) des erfindungsgemäßen Verfahrens) und mit Wasser gewaschen (Schritt (V) des erfindungsgemäßen Verfahrens).

Der Filterwiderstand wurde zu α = 6 10+1° 1/m2 bestimmt, die Restfeuchte im Kuchen lag bei 30,5 % und die isolierte Ausbeute betrug 89 %. Die Kristallgröße wurde anhand von mikroskopischen Bildern zu 400 μιη abgeschätzt.

Das Kristallisat lag in der Modifikation I vor. Der Gehalt des Kristallisats an Ortho- Aminobenzoesäure lag bei 98,5 %, der Aschegehalt betrug 0,03 %.

Beispiel 5 (semi-kontinuierliche Durchführung von Schritt (III) - kontinuierliche Zuführung von Salzsäure und Fermentationsbrühe, absatzweise Entnahme von Suspension zu einer Suspension an Impfkristallen)

Beispiel 5 wurde durchgeführt wie Beispiel 4 mit dem Unterschied, dass nicht nur die Edukte Fermentationsbrühe und Salzsäure kontinuierlich zudosiert wurden, sondern auch Suspension absatzweise entnommen wurde, was einer vollkontinuierlichen Fahrweise nahe kommt. Die Dosierung der Edukte Salzsäure und Fermentationsbrühe erfolgte so, dass sich eine Verweilzeit der Kristalle im Reaktor von ca. 45 min ergab. Der pH- Wert variierte zwischen 3,2 und 3,5. Alle 15 min wurde Suspension entnommen (jeweils 60 ml bei 200 ml Gesamtansatzgröße) und charakterisiert.

Die Restfeuchte im Filterkuchen lag bei 1 % und die isolierte Ausbeute betrug 91 %. Die Kristallgröße wurde anhand von mikroskopischen Bildern zu 400 μιη abgeschätzt.

Das Kristallisat lag in der Modifikation I vor. Der Gehalt des Kristallisats an Ortho- Aminobenzoesäure lag bei 99 %, der Aschegehalt betrug 0,02 %.