In Bearbeitung

Bitte warten ...

Einstellungen

Einstellungen

Gehe zu Anmeldung

1. WO2005052188 - VERFAHREN ZUR HYBRIDISIERUNG BIOLOGISCHER MAKROMOLEKÜLE AUF AN EINER FESTKÖRPEROBERFLÄCHE GEBUNDENE DOPPELSTRÄNGIGE NUKLEINSÄUREABSCHNITTE

Anmerkung: Text basiert auf automatischer optischer Zeichenerkennung (OCR). Verwenden Sie bitte aus rechtlichen Gründen die PDF-Version.

[ DE ]

Verfahren zur Hybridisierung biologischer Makromoleküle auf an einer Festkorperoberflache gebundene doppelsträngige Nukleinsäureabschnitte

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Hybridisierung biologischer Makromoleküle auf an einer Festkorperoberflache gebundene Nukleinsäureabschnitte, bei dem eine Festkorperoberflache mit zumindest einem Spot mit ersten daran gebundenen, zumindest teilweise doppelstrangig vorliegenden Nukleinsäureabschnitten bereitgestellt wird und eine Flüssigkeit mit biologischen Makromolekülen auf diese Festkorperoberflache aufgebracht wird.

Derartige Nukleinsäureabschnitte sind z. B. PCR-(Polymerase Chain Reaction, Polymerase Kettenreaktion)-Produkte oder genomische DNA.

Die PCR ist ein bekanntes Verfahren zur Vervielfältigung spezifischer DNA-Sequenzen, wie es z. B. in US 4,683,195 A und US 4,683,202 A beschrieben ist. Es werden hierbei in der Regel zwei komplementäre Stränge vervielfältigt. PCR-Produkte können wie folgt als „Sonden" in Microarray-Experimenten eingesetzt werden. Derartige Microarrays umfassen eine Festkorperoberflache, z. B. einen Chip, von typischerweise einigen mm2 bis einigen cm2 Fläche. Auf der Festkörperoberfläche befindet sich in der Regel eine Vielzahl einzelner Spots, wobei der Abstand solcher Spots z. B. einige 10 μm bis einige Millimeter sein kann. Vorteilhafterweise sind die Spots in der Form eines ein- oder zweidimensionalen Arrays angeordnet, wodurch die automatisierte Behandlung vereinfacht wird. Derartige Microarrays und ihre Verwendung speziell für biologische Untersuchungen sind in „DNA Microarrays", herausgegeben von M. Schena, Oxford University Press, N.Y., 2000 (Seiten 130/131) allgemein beschrieben. Eine Vorrichtung, mit der Hybridisierungsprozesse auf einem Microarray untersucht werden können, ist Gegenstand der DE 101 42 789 C1.

Bei bekannten Microarray-Experimenten werden zunächst Microarrays hergestellt, indem man z. B. PCR-Produkte in Form eines ein- bzw. zweidimensionalen Arrays auf eine Festkorperoberflache aufbringt, z. B. ähnlich einem Ink-Jet-Verfahren spottet oder unter Verwendung eines Kontaktdruckverfahrens. Die PCR-Produkte liegen im allgemeinen doppelstrangig vor und haben eine Länge von etwa 200 bis 2000 Basenpaaren. Die Bindung an der Festkorperoberflache bzw. die Quervernetzung kann z. B. durch UV-Cross-Linking oder durch Festbacken bei hoher Temperatur erfolgen. Typische Spotdurchmesser liegen bei etwa 100 μm und die Zahl der Spots pro Microarray kann bis zu 100.000 betragen.

Gegen die so an der Festkorperoberflache gebundenen PCR-Produkte werden andere biologische Makromoleküle, z. B. cDNA-Moleküle oder andere PCR-Produkte hybridisiert, deren Sequenzen zumindest teilweise komplementär zu den gespotteten PCR-Produkten sind. Dazu werden die cDNA-Moleküle bzw. die weiteren PCR-Produkte in Lösung auf das Microarray mit den gespotteten PCR-Produkten aufgebracht und so die Reaktion ermöglicht.

Nach einer typischen Reaktionszeit kann in bekannter Weise untersucht werden, ob bzw. in welchem Maße eine Reaktion der Moleküle in der Lösung mit den an den Spots gebundenen PCR-Produkten stattgefunden hat. Dazu kann z. B. die Fluoreszenz entsprechend präparierter Moleküle untersucht werden.

An einem Spot des Microarrays findet folgender Reaktionsablauf statt. Während der Hybridisierungsreaktion kommt es zu einer kompetitiven Bindung zwischen dem jeweils ersten Strang (im folgenden auch „Sonde") der an dem Spot gebundenen Nukleinsäureabschnitte und dem ebenfalls gebundenen Komplementärstrang (im folgenden auch „komplementäre Sonde") einerseits und den biologischen Makromolekülen in der Lösung (im folgenden auch „Probenmoleküle") andererseits. Da lokal in der Regel eine höhere Dichte von Sonden und den ebenfalls gebundenen komplementären Sonden vorliegt als von den Molekülen in der Lösung, ist die Zahl der Sonden, die für eine Reaktion mit den Molekülen aus der Lösung zur Verfügung stehen, eher gering. Typischerweise befinden sich pro Spot eines beispielhaften Durchmessers von 100 μm etwa 106 bis 108 Sonden, von denen aber nur etwa 1 Promille bis 10 Prozent für eine Bindung mit Molekülen in der Lösung zur Verfügung steht. Gründe hierfür sind geometriebedingte sterische Hinderung oder kom-petitive Renaturierung (Reassoziation), also die Reaktion mit einer komplementären Sonde. Andererseits sind in einem Genexpressionsexperiment etwa 104 bis 109 biologische Makromoleküle, also z. B. cDNA-Moleküle innerhalb des Diffusionsradius in der Lösung vorhanden, so daß für stark exprimierte Gene innerhalb des typischen Diffusionsradius eines über-Nacht-Experimentes nicht genügend Bindungsstellen zur Verfügung stehen und das Signal in die Sättigung übergeht.

Zur Lösung dieser Problematik werden heutzutage bereits beim Spotten von PCR-Produkten auf die Festkorperoberflache denaturierende Substanzen (z. B. DMSO, Dimethylsulfoxid) zugegeben, die verhindern sollen, daß die PCR-Produkte, die an den Spots gebunden sind, renaturieren (reassoziieren). Während der Hybridisierungsreaktion selbst können derartige denaturierende Substanzen allerdings nicht in hoher Konzentration präsent sein, da sonst auch eine Bindung einer an einem Spot gebundenen Sonde mit einem komplementären Molekül aus der Lösung nicht möglich wäre. Während der Hybridisierungsreaktion bildet sich also die doppel-strängige Ausführung des an den Spots gebundenen PCR-Produktes teilweise wieder aus, so daß auch bei dieser bekannten Verfahrensführung die oben beschriebene kompetitive Reaktion stattfindet.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein verbessertes Verfahren zur Hybridisierung biologischer Makromoleküle auf an einer Festkorperoberflache gebundene Nukleinsäureabschnitte anzugeben, bei dem die Zahl der Sonden, die für die Bindung zur Verfügung stehen, erhöht ist und das Signal-Rausch-Verhältnis verbessert ist.

Diese Aufgabe wird mit einem Verfahren zur Hybridisierung gelöst, das die Merkmale des Anspruches 1 aufweist. Vorteilhafte Verwendungen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind Gegenstand des Anspruches 11. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind Gegenstand von Unteransprüchen.

Das erfindungsgemäße Verfahren beruht auf einer Kombination von Temperaturschritten und dem Mischen bzw. Bewegen der Moleküle in der Lösung.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird eine Festkorperoberflache bereitgestellt, die zumindest einen Spot aufweist, an dem erste Nukleinsäureabschnitte gebunden sind, die zumindest teilweise doppelstrangig vorliegen. Auf diese Festkorperoberflache wird eine Flüssigkeit mit biologischen Makromolekülen aufgebracht, die mit den an den Spots gebundenen Nukleinsäureabschnitten reagieren sollen. Die Temperatur wird z. B. mit einer Widerstandsheizung auf einen Wert erhöht, bei dem möglicherweise existierende Bindungen zwischen den beiden Strängen der an den Spots zumindest teilweise doppelstrangig vorliegenden Nukleinsäureabeschnit-te wenigstens zum Teil gelöst werden. Die Temperatur wird also so hoch gewählt, daß die auf der Festkorperoberflache renaturierten Doppelstränge aufbrechen. Die notwendige Temperaturerhöhung ist abhängig von den verwendeten Sonden und kann typischerweise z. B. einige wenige Grad bis zu einigen wenigen zehn Grad betragen. Während dieses Schrittes befindet sich die Flüssigkeit vorteilhafterweise in Ruhe. Nach dem Absenken der Temperatur bzw. Abkühlenlassen auf die typische Hybridisierungsprozeßtemperatur wird eine typische Reaktionszeit abgewartet, während der Makromoleküle aus der Flüssigkeit mit den Einzelsträngen der Nukleinsäureabschnitte an den Spots hybridisieren können. Während dieser Reaktionszeit hybridisieren Moleküle aus der Flüssigkeit mit den an den Spots gebundenen Sonden, z. B. bis eine Sättigung erreicht ist. Durch den Hybridisie-rungsprozeß von Molekülen aus der Flüssigkeit an den Nukleinsäureabschnitten der Spots entsteht in der Umgebung der Spots eine lokale Verarmung an zur Reaktion mit den Nukleinsäureabschnitten an den Spots zur Verfügung stehenden Molekülen. Während des Hybridisierungsprozesses und/oder danach wird die Flüssigkeit in Bewegung versetzt, um die so entstandene lokale Verarmung aufzuheben. Durch diesen erfindungsgemäßen Schritt ist gewährleistet, daß im Diffusionsradius um die einzelnen Spots herum wieder im wesentlichen die ursprüngliche Anzahl von für die Reaktion zur Verfügung stehenden Makromolekülen in der Flüssigkeit vorliegt.

Der Schritt der Temperaturerhöhung kann direkt nach dem Aufbringen der Flüssigkeit mit den biologischen Makromolekülen auf der Festkorperoberflache durchgeführt werden, um Bindungen von an den Spots gebundenen Sonden und an den Spots gebundenen komplementären Sonden zu lösen. Bei einer alternativen Verfahrensführung wird nach dem Aufbringen der Flüssigkeit mit den biologischen Makromolekülen auf die Festkorperoberflache zunächst eine typische Reaktionszeit zwischen den biologischen Makromolekülen und den an dem zumindest einen Spot gebundenen Nukleinsäureabschnitten abgewartet. Während dieser Reaktionszeit können Moleküle aus der Flüssigkeit mit den an den Spots gebundenen Nukleinsäureabschnitten, die nicht doppelstrangig vorliegen, hybridisieren. Die dadurch oberhalb der Spots entstehende lokale Verarmung an zur Reaktion mit den Nukleinsäureabschnitten zur Verfügung stehenden Molekülen wird durch Versetzen der Flüssigkeit in Bewegung aufgehoben. Dieser Schritt der alternativen Verfah-rensführung gewährleistet, daß im Diffusionsradius um die einzelnen Spots herum wieder im wesentlichen die ursprüngliche Anzahl von für die Reaktion zur Verfügung stehenden Makromolekülen in der Flüssigkeit vorliegt.

Während der Hybridisierungsprozesse befindet sich das System bei einer Temperatur unterhalb derjenigen Temperatur, die zum Aufbrechen der Hybridisierungs- bindungen notwendig ist. Typische Hybridisierungstemperaturen liegen je nach verwendeten Nukleinsäureabschnitten und Puffern z. B. zwischen 35°C und 65°C.

Die Bewegung in der Flüssigkeit kann durch einen Rühr- oder Schüttelprozeß erreicht werden. Besonders vorteilhaft ist die Applikation von Schallwellen, vorzugsweise Oberflächenschallwellen auf der Festkorperoberflache. Der Impulsübertrag derartiger Schallwellen bzw. Oberflächenschallwelien auf die Flüssigkeit bewirkt eine effektive und präzise Bewegung der Flüssigkeit auf der Oberfläche. Die Verwendung von Oberflächenschallwellen zur Erzeugung von Bewegung in kleinen Flüssigkeitsmengen ist allgemein in DE 101 42 789 C1 beschrieben. Vorrichtungen zur Erzeugung von Oberflächenschallwellen, z. B. Interdigitaltransducer, lassen sich einfach und kostengünstig auf einer Festkorperoberflache realisieren.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann auf einem einzelnen Spot durchgeführt werden. Vorteilhafterweise wird zur Parallelisierung der Prozeßführung jedoch ein Microarray eingesetzt, wobei ggf. an unterschiedlichen Spots dieses Microarrays unterschiedliche Nukleinsäureabschnitte gebunden sind.

Das erfindungsgemäße Verfahrensprotokoll kann mehrfach durchlaufen werden, wobei sich bei jedem Zyklus die Zahl der Bindungen der Makromoleküle aus der Flüssigkeit mit den Nukleinsäureabschnitten an den Spots erhöht.

Beim zyklischen Durchführen der Schritte der Temperaturerhöhung, des Absen-kens der Temperatur, des Abwartens einer typischen Reaktionszeit und des Ver-setzens der Flüssigkeit in Bewegung kann vorteilhafterweise in jedem Zyklus zunächst die typische Reaktionszeit abgewartet werden und die Flüssigkeit erst dann in Bewegung versetzt werden. Durch den Temperaturerhöhungsschritt werden Bindungen von Probenmolekülen an Sondenmolekülen auf den Spots zumindest zum Teil wieder gelöst, die während des vorhergehenden Zyklus entstanden sind. Durch diesen temperaturinduzierten Bindungslösungsprozeß kommt es zu einer lokalen Konzentrationserhöhung von Probenmolekülen in der Umgebung des Spots, so daß in dem folgenden Hybridisierungsschritt eine größere Anzahl von Probenmole- külen für eine Bindung an Sondenmoleküle des Spots zur Verfügung steht. Wird gemäß der vorteilhaften Ausgestaltung des Verfahrens beim zyklischen Durchführen nach dem Abkühlen zunächst die typische Reaktionszeit abgewartet und die Flüssigkeit erst dann wieder in Bewegung versetzt, so ist gewährleistet, daß während der typischen Reaktionszeit diese lokale Konzentrationserhöhung nicht durch eine Bewegung der Flüssigkeit wieder aufgehoben wird.

Werden die einzelnen Schritte nur jeweils einmal durchgeführt, kann die Flüssigkeit bereits während oder nach der Erhöhung der Temperatur in Bewegung versetzt werden, um ausreichend Makromoleküle im Diffusionsradius um den Spot zur Verfügung zu stellen.

Die typischen Reaktionszeiten zwischen den in der Flüssigkeit vorhandenen Makromolekülen und an den Spots gebundenen Nukleinsäureabschnitten und die einzusetzenden Temperaturen während des Bindungslösungsprozesses können durch Vorabexperimente bestimmt werden oder aus Werten abgeschätzt werden, die für die Hybridisierung der verwendeten Materialien bzw. für das Aufbrechen der Bindung zwischen diesen Materialien bekannt sind.

Wird während des Schrittes des Abwartens einer typischen Reaktionszeit die Flüssigkeit nicht in Bewegung versetzt, also insbesondere gemäß der geschilderten vorteilhaften Ausgestaltung des Verfahrens bei zyklischer Durchführung, so umfaßt die typische Reaktionszeit zumindest diejenige Zeit, die die Probenmoleküle benötigen, um aus dem Diffusionsradius an die Sonden auf den Spots zu gelangen.

Besonders vorteilhaft läßt sich das erfindungsgemäße Verfahren zur Hybridisierung von zweiten Nukleinsäureabschnitten in der Flüssigkeit an ersten Nukleinsäureabschnitten, die an der Festkorperoberflache gebunden sind, einsetzen. Dabei können die ersten und/oder die zweiten Nukleinsäureabschnitte z. B. PCR-Produkte, cDNA-, genomische DNA- oder RNA-Moleküle sein.

lm folgenden wird anhand eines Beispielexperimentes eine Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens im Detail geschildert. Das beschriebene Beispiel beschreibt die Hybridisierung von cDNA-Molekülen an PCR-Produkten, die an der Festkorperoberflache in Spots gebunden sind.

Zur Erläuterung wird beispielhaft angenommen, daß die Zahl der PCR-Produkte auf einem Spot je Strang 108 betragen soll. Etwa 1 Prozent, also 106 PCR-Produkte stehen dann typischerweise in einem über-Nacht-Experiment zur Hybridisierung zur Verfügung, da nur diese Zahl einzelsträngig vorliegt.

Auf die derart vorbereitete Festkorperoberflache mit den PCR-Produkten an den Spots wird eine Flüssigkeit mit fluoreszenzmarkierten, zu den PCR-Produkten an den Spots zumindest teilweise komplementären Probenmolekülen, z. B. cDNA-Moleküle in einer Menge von z. B. 106 Molekülen in einem Volumen der Dimension eines Diffusionsradius eines typischen über-Nacht-Experimentes (ca. 1 mm) aufgebracht. Insgesamt stehen auf einem Array von ca. 1 cm2 etwa 108 Probenmoleküle für die Bindung zur Verfügung.

Unter den geschilderten Bedingungen wäre das Signal nach einem über-Nacht-Experiment in Sättigung. Weder eine Verlängerung der Hybridisierungszeit noch das Versetzen der Probenlösung in Bewegung führen zu einer Erhöhung des Signales, obwohl nur etwa 1 Prozent der vorhandenen cDNA-Moleküle eine Bindung eingegangen sind. Ein Grund hierfür ist die Konkurrenzreaktion, die aus der Bindung der beiden komplementären Stränge der gebundenen PCR-Produkte besteht.

Gemäß einer Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Signal durch folgende Verfahrensführung erhöht. Dabei ist auch ein mehrmaliges Durchlaufen des Zyklus möglich.

Die Temperatur wird auf einen Wert erhöht, daß die Bindungen sowohl der cDNA-Moleküle mit den an den Spots gebundenen Sonden als auch die Bindung der komplementären Stränge der gebundenen PCR-Produkte untereinander zumindest zum Teil wieder aufschmelzen. Je nach Material liegt diese Temperatur typischerweise z. B. einige Grad bis einige zehn Grad höher. Während dieses Schrittes ist die Probenflüssigkeit in Ruhe. Nachdem sich die Temperatur wieder auf die normale Hybridisierungstemperatur abgesenkt hat, können die cDNA-Moleküle in der Lösung mit den Sonden, also Einzelsträngen der an den Spots gebundenen PCR-Produkte hybridisieren. Während oder nach dem Hybridisierungsschritt wird die Flüssigkeit z. B. durch Applikation von Oberflächenschallwellen für z. B. für eine Stunde in Bewegung versetzt, um innerhalb des Diffusionsradius um die einzelnen Spots herum trotz der durch die Hybridisierung hervorgerufenen lokalen Verarmung an zur Reaktion zur Verfügung stehenden Makromolekülen eine ausreichende Anzahl von Makromolekülen in der Flüssigkeit aufrecht zu erhalten.

Die Schritte der Erhöhung der Temperatur, der Abkühlung und des Abwartens einer typischen Reaktionszeit können zyklisch durchlaufen werden. Während bei nur einfacher Ausführung der Prozeßschritte die Flüssigkeit bereits während der Temperaturerhöhung, der Temperaturerniedrigung und des Abwartens einer typischen Reaktionszeit in Bewegung versetzt werden kann, um eine ausreichende Anzahl von Molekülen im Diffusionsradius zur Verfügung zu stellen, wird beim zyklischen Durchlaufen der einzelnen Prozeßschritte vorteilhafterweise zunächst die typische Reaktionszeit gewartet und dann die Flüssigkeit in Bewegung versetzt, um für den nächsten Zyklus ausreichend Makromoleküle in der Flüssigkeit innerhalb des Diffusionsradius um die Spots zur Verfügung zu stellen.

Bei mehrfachem Durchlaufen des Zyklus werden bei dem Temperaturerhöhungsschritt sowohl die Bindungen zwischen den cDNA-Molekülen mit den an den Spots gebundenen PCR-Produkten als auch die Bindung der komplementären Stränge der gebundenen PCR-Produkte untereinander zumindest zum Teil wieder aufgeschmolzen. Durch diesen temperaturinduzierten Bindungslösungsprozeß kommt es zu einer lokalen Konzentrationserhöhung von cDNA-Molekülen oberhalb des Spots, deren Zahl sich nun mit 2 x 106 gegenüber der Ausgangskonzentration verdoppelt hat. Bei dem folgenden Hybridisierungsschritt nach Wiederabkühlung konkurriert jetzt die doppelte Zahl von cDNA-Molekülen mit einer konstanten Anzahl komplementärer Sonden von gebundenen PCR-Produkten um eine spezifische Bindung mit gebundenen Sonden im Vergleich zur Ausgangskonzentration. Dadurch wird die Zahl der cDNA-Moleküle, die eine Bindung eingehen wird, erhöht. Bei jedem Zyklus erhöht sich daher die Zahl der gebundenen cDNA-Moleküle.