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1. (WO2004079771) DREIDIMENSIONALE ABBILDUNG DER CHEMISCHEN OBERFLÄCHENZUSAMMENSETZUNG VON OBJEKTEN
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Dreidimensionale Abbildung der chemischen Oberflächenzusammensetzung von Objekten

Ziel der ortsaufgelösten mikroskopischen Oberflächenanalytik ist es, die chemische Zusammensetzung einer Probe (z.B. einer biologischen Zelle, eines biologischen Gewebes oder einer Halbleiterprobe) mit hoher Auflösung qualitativ und / oder quantitativ abzubilden. Anders als ein optisches Mikroskopbild zeigt ein solches analytisches Bild die Mengenverteilung eines bestimmten Stoffes innerhalb einer Probe als Bild an (z.B. als Graustufenbild). Dies ist in zweidimensionalen Abbildungen bisher unter anderem mit Hilfe lasergestützter, massenspektrometrischer Verfahren möglich. Mit der vorliegenden Erfindung ist es nun zusätzlich möglich, auch die dritte Dimension, d.h. die Höhe des Probenbereiches, aus dem der gemessene Stoff stammt, zu bestimmen und in einer bildlichen Darstellung abzubilden. Somit kann die dreidimensionale, räumliche Struktur einer Oberfläche abgebildet und gleichzeitig in der chemischen Zusammensetzung bestimmt werden.

Die Erfindung beschreibt eine Vorrichtung und ein Verfahren, um die chemische Zusammensetzung und die dreidimensionale Struktur, d.h. insbesondere die dreidimensionale Zusammensetzung in Gemischen chemischer und biologischer Proben zu messen, die Messdaten auszuwerten und anschließend graphisch darzustellen.

Beschreibung und Stand der Technik

Der Stand der Technik kennt zahlreiche Methoden, um die chemische Zusammensetzung der Oberfläche einer Probe mit hoher Auflösung qualitativ und / oder quantitativ abzubilden. Bei den Proben kann es sich beispielsweise um biologische Zellen, biologische Gewebe oder Halbleiterproben handeln. Die mikroskopische, ortsaufgelöste Oberflächenanalytik liefert dabei analytische Bilder, die im Gegensatz zu optischen
Mikroskopbildern die Mengenverteilung eines bestimmten Stoffes innerhalb einer Probe anzeigen. Bisher existieren jedoch lediglich Methoden zur zweidimensionalen Abbildung von Probenoberflächen .

Ziel der ortsaufgelösten mikroskopischen Oberflächenanalytik ist es, die chemische Zusammensetzung einer Probe (z.B. einer biologischen Zelle, eines biologischen Gewebes oder einer Halbleiterprobe) mit hoher Auflösung qualitativ und / oder quantitativ abzubilden. Anders als ein optisches Mikroskop-bild zeigt ein solches analytisches Bild die Mengenverteilung eines bestimmten Stoffes innerhalb der Probe als Bild an. Es sind zahlreiche Methoden zur Analyse und zweidimensionalen Abbildung der Oberflächenzusammensetzung von Stoffen bekannt. Darunter befinden sich lasergestützte, massenspektrometrische Verfahren. Keines der dem Fachmann bekannten Verfahren gestattet es jedoch, Informationen über die Topologie eine Probe zu gewinnen: Es gibt keine Verknüpfung zwischen der zweidimensionalen, räumlichen Verteilung eines Stoffes und der Höhe bzw. Dicke einer Probe an einem bestimmten Ort. Die konfokale Laser-Raster-Mikroskopie liefert zwar dreidimensionale Informationen, jedoch keine direkte Information über die chemische Zusammensetzung der Probe.
Verschiedene Verfahren werden für die mikroskopische Oberflächenanalytik genutzt. Dazu gehören beispielweise die Elektro- nenemissionsspektroskopie (EES) , die Laserdesorptions-Ionisation (LDI) , die Lasermikrosonden-Massenspektrometrie (in der Literatur abgekürzt als LAMMA, LAMMS, LIMA, LIMS) , die Flugzeit-Massenspektrometrie (Time of Flight Mass
Spectrometry, TOF-MS) , die MALDI-MS (Matrix-assisted Laser Desorption-Ionization Mass Spectrometry, MALDI-MS) sowie die Sekundärionen-Massenspektrometrie (Secondary Ion Mass
Spectrometry, SIMS) . MALDI-Analysen sind bisher auf laterale Auflösungen von ca. 30 μm beschränkt, so dass die Anwendung der MALDI auf relativ große Strukturen beschränkt ist. Mit

Hilfe der SIMS sind bislang nur Informationen über die oberste Schicht einer Probe erhältlich.

Die WO 99/15884 beschreibt ein Verfahren zur Einschichten-Analyse unter Verwendung der dynamischen Sekundärionen- Massenspektrometrie (SIMS) , bei der entweder der Teilchenstrahl oder die Probe mit Hilfe eines Verschiebetisches bewegt werden können. Auf diese Weise kann die Probe abgetastet werden, um ein zweidimensionales Abbild ihrer Oberfläche zu erhalten. Dreidimensionale Abbildungen können mit diesem

Verfahren nicht gewonnen werden.

Ein Verfahren zur zweidimensionalen SIMS wird beispielsweise in der US 5,650,616 beschrieben, bei dem die zu untersuchende Probe mit laserinduzierter Plasmastrahlung abgetastet wird. Dabei wird der Ort der Probenoberfläche, auf den die Strahlung konvergiert wird, in Übereinstimmung mit der x,y-Bewegung eines Verschiebetisches verändert, auf dem sich die Probe befindet. Emittierte abgelenkte und nicht abgelenkte Sekundärionen werden über ein TOF-MS oder ein anderes Mas-senspektrometer detektiert, wobei der Anteil der abgelenkten Sekundärionen durch Veränderung von Spannung und / oder Magnetfeld des MS-Gerätes kontrollierbar ist.

Die US 5,808,300 beschreibt ein MALDI-MS-Verfahren zur zweidimensionalen Kartierung von Konzentrationen spezifischer Moleküle, bei der definierte Punkte einer Probenoberfläche mit einem fokussierten Laserstrahl beschossen werden und das Molekülfenster der freigesetzten Ionen detektiert wird, bevor der nächste Probenpunkt beschossen wird. Die Abbildung der analysierten Massen erfolgt bei der US 5,808,300 als Funktion der linearen Distanz zwischen zwei Laserpunkten.

Es ist bekannt, dass Ionen, deren Entstehungsorte auf der Probenoberfläche identische x- und y- , aber verschiedene z-Koordinaten besitzen, unterschiedliche Energien und damit Flugzeiten benötigen, um zum Detektor eines Massenspektrome-ters zu gelangen. Andererseits führt der Ionenentstehungspro-zess zwangsläufig zu Anfangsenergieverteilungen und damit auch zu unterschiedlichen Geschwindigkeiten der Ionen. Die bisher bekannten Methoden zur Oberflächenanalyse gestatten lediglich die Bestimmung der zweidimensionalen Zusammensetzung von Objekten, da sich die beiden Effekte, welche die Energie und damit Geschwindigkeit der Ionen beeinflussen

(Anfangsenergieverteilung einerseits und aus unterschiedlichen Starthöhen resultierende Flugzeit andererseits) , gegenseitig überlagern.

Überraschend und im Widerspruch zum Stand der Technik wurde gefunden, dass es mit Hilfe der erfindungsgemäßen, optimierten Vorrichtung möglich ist, eine Abhängigkeit der Flugzeit vom Entstehungsort der Ionen in karthesischer z-Richtung zu erzeugen, die größer ist als die Abhängigkeit der Flugzeiten von den Anfangsenergieverteilungen. Damit ist es erstmals möglich, alle drei Raumrichtungen (karthesische Koordinaten x, y und z) des Herkunftsortes eines Ions zu bestimmen. Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Auswertungsverfahrens ist es außerdem möglich, diese Ortsinformationen in bildliche Darstellungen umzusetzen.

Aufgabe der Erfindung
Aufgabe der Erfindung ist es, eine Vorrichtung zur Analyse von Substanzgemischen aus räumlich begrenzten Bereichen einer zu untersuchenden Probe bereitzustellen, die es erstmalig erlaubt, die Energievariationen der erzeugten Ionen zur
Bestimmung aller drei Raumkoordinaten ihres Herkunftsortes auf der Probenoberfläche zu nutzen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch den Gegenstand des Anspruchs 1. Den Kern der Erfindung bildet eine Vorrichtung in Form einer Ionenquelle, die aus einer oder mehreren ein permanentes elektrisches Feld erzeugenden Be-schleunigungszonen besteht, und die eine hohe Feldstärke im Bereich der Probenoberfläche erzeugt, wobei die Ionenquelle die folgende Aufgaben erfüllt:
1. räumliche Fokussierung des Ionenstrahls aus der Ionenquelle heraus auf den Ionendetektor
2. zeitliche Fokussierung des Ionenstrahls auf den Detektor 3. Erzeugung einer großen Abhängigkeit der Flugzeit vom
Entstehungsort der Ionen

Die dem Fachmann bekannten Ionenquellen bestehen aus einer oder mehreren Beschleunigungszonen. Unter der ersten Beschleunigungszone wird dabei der Bereich zwischen der ersten Beschleunigungselektrode, die als Probenoberfläche ausgebildet ist, und der zweiten Beschleunigungselektrode verstanden, wobei es sich bei der zweiten Beschleunigungselektrode bei-spielsweise eine Lochblende handelt. An die Probenoberfläche wird dabei ein höheres Potential angelegt als an die zweite Beschleunigungselektrode (Lochblende) . Aus der Probe freigesetzte Ionen werden in Richtung auf die zweite
Beschleunigungselektrode beschleunigt. Zwei freigesetzte Ionen, deren Entstehungsort sich nur in der z-Koordinate Entstehungsort sich nur in der z-Koordinate unterscheidet, erfahren dabei unterschiedliche Beschleunigungen und damit unterschiedliche kinetische Energien. Als z-Richtung wird dabei der Abstand des Startortes (Entstehungsortes) des Ions von der zweiten Beschleunigungselektrode, beispielweise einer Lochblende, betrachtet: Je weiter der Startort eines Ions, in z-Richtung betrachtet, von der zweiten Beschleunigungselektrode entfernt ist, desto größer ist die kinetische Energie, die dieses Ion auf dem Weg von der ersten zur zweiten Be-schleunigungselektrode erfährt, d.h. dass Ionen aus tieferen Probenschichten eine höhere kinetische Energie besitzen als Ionen, die von höheren Startorten der Probenoberfläche aus beschleunigt werden. Eine geringere kinetische Energie eines Ions verlängert die Flugzeit, die es benötigt, um den Ionen-detektor zu erreichen. Auf der anderen Seite legen Ionen aus erhöhten Startorten eine kürzere Flugstrecke bis zum Ionendetektor zurück. Bei gleicher kinetischer Energie führt dies zu einer Flugzeitverkürzung des von einem höheren Startort gestarteten Ions auf dem Weg zum Detektor. Dabei wird die Flugzeit, die Ionen von der Probenoberfläche bis zum Detektor benötigen, als Gesamtflugzeit und die dabei zurückgelegte Strecke als Gesamtflugstrecke bezeichnet.
Unter hoher Feldstärke ist dabei in der vorliegenden Erfindung eine Feldstärke zu verstehen, die mindestens so groß ist, dass die Flugzeitverkürzung, die durch die verkürzte

Flugstrecke entsteht, überkompensiert wird durch die verlängerte Flugzeit, die auf Grund der verringerten kinetischen Energie entsteht. Bei einer angenommenen Gesamtflugstrecke zwischen Probenentstehungsort und Ionendetektor von 1 m erzeugt ein Probenentstehungsort, der sich 1 μm oberhalb des

Probenträgers befindet, eine relative Verkürzung der Flugzeit um 1 Millionstel (= 1*10~6) . Bei einer Flugstrecke von 2 m beträgt diese Verkürzung 0,5 Millionstel, d.h. 1 μm Höhendifferenz des Startortes dividiert durch die Gesamtflugstrecke von 2 m, entsprechend 2 Millionen μm. Gleichzeitig erzeugt die geringere aufgenommene kinetische Energie der Ionen, die von z2 starten, eine Flugzeitverlängerung.
Hierbei gilt:
ti/ta = (Ekin2/Ekinl) 1/2
mit
ti = Flugzeit eines Ions, das von einem Startort zx von der
Probenoberfläche gestartet ist
t2 = Flugzeit eines Ions, das von einem Startort z2 von der
Probenoberfläche gestartet ist
Ekini = kinetische Energie des Ions mit Startort zx
Ekin2 = kinetische Energie des Ions mit Startort z2

Ist der Abstand zwischen z2 und der zweiten Beschleunigungs-elektrode (beispielsweise Lochblende) geringer als der Abstand zwischen z und dieser Beschleunigungselektrode, so beträgt diese Verlängerung der Flugzeit des von z2 aus gestarteten Ions gegenüber dem von z aus gestarten Ion beispielsweise bei einer angenommenen ersten Feldstärke von 13 V/mm und einer Gesamtbeschleunigungsspannung von 13 kV ebenfalls 1 Millionstel der Gesamtflugzeit.
Die Beschleunigungsfeldstärke in der ersten Beschleunigungs-strecke, d.h. der Strecke zwischen erster und zweiter Beschleunigungselektrode, ist daher erfindungsgemäß größer zu wählen, als der Gesamtbeschleunigungsspannung pro Meter

Gesamtflugstrecke entspricht . Wäre die Beschleunigungsfeldstärke in der ersten Beschleunigungsstrecke ebenso groß, wie es der Gesamtbeschleunigungsspannung pro Meter Gesamt-flugstrecke entspricht, so würden sich die beiden oben aufge-führten Effekte (höher kinetische Energie von Ionen aus tieferen Probenschichten bei gleichzeitig verlängerter Flugzeit) gerade kompensieren. Wäre die Beschleunigungsfeldstärke in der ersten Beschleunigungszone kleiner, als es der Gesamtbeschleunigungsspannung pro Meter Gesamtflugstrecke ent- spricht, so würden Ionen aus tieferen Probenschichten trotz ihrer höheren kinetischen Energie auf Grund ihrer längeren Flugzeit den Ionendetektor später erreichen als Ionen aus höheren Probenschichten. Dabei muss die erfindungsgemäß anzulegende erste Beschleunigungsfeldstärke geringer sein als die Durchschlagsspannung, wobei unter Durchschlagsspannung diejenige Spannung verstanden wird, die zu elektrischen
Überschlägen zwischen Probenoberfläche und Blende führt.
Bevorzugt werden erste Beschleunigungsfeldstärken von 700-800 V/mm angelegt.
Die räumliche Fokussierung des Ionenstrahls wird erzielt durch Verwendung inhomogener elektrischer Felder, die in der Lage sind, Ionenbündel seitlich abzulenken, um den Ionenstrahl räumlich auf den Ionendetektor zu fokussieren und auf diese Weise eine effektive Transmission zu erzielen. Die zur räumlichen Fokussierung notwendigen inhomogenen Felder werden beispielsweise durch Lochblenden oder Spalte erzeugt. Alternativ sind auch Quadrupol-Ionenleiter einsetzbar. Die zeitliche Fokussierung wird erreicht durch dem Fachmann bekannte Kombinationen von Felddimensionen (Elektrodenabständen) und Potentialen, die beispielsweise in Hermann Wollnik, „Optics of Charged Particles", Academic Press 1987, nachgeschlagen werden können. Wie oben erwähnt, ist dem Fachmann bekannt, dass es während des Ionenentstehungsprozesses zu Anfangsener-gieverteilungen kommt, die zu Flugzeitverteilungen führen.

Die erfindungsgemäße Kombination von inhomogenen elektrischen Feldern, Öffnungsdurchmessern, Elektrodenabständen und Potentialen, im Folgenden als Ionenquellenparameter bezeichnet, minimiert diese aus dem Ionenentstehungsprozess resultieren-den Variationen der Gesamtflugzeit derart, dass Energievariationen, die erfindungsgemäß durch die Topologie der Probe entstehen, stärker sind als die Effekte aus dem Ionenentstehungsprozess. Die zeitliche Fokussierung eines Ionenstrahls durch geeignete Wahl der Ionenquellenparameter ist dem Fach- mann bekannt, beispielsweise als Wiley-McLaren-Anordnung, in der zwei Beschleunigungsfelder verwendet werden.
Die Erzeugung einer großen Abhängigkeit der Flugzeit eines Ions von der karthesischen z-Koordinate seines Entstehungor-tes wird erfindungsgemäß erreicht, indem aus dem Satz geeigneter Ionenquellenparameter, beispielsweise aus dem Satz möglicher Wiley-McLaren-Parameter, solche ausgewählt werden, die die jeweils höchst mögliche Feldstärke in der ersten Beschleunigungszone erzeugen. Die Auswahl der Wiley-McLaren-Parameter ist dem Fachmann bekannt und wird beispielsweise in Hermann Wollnik, „Optics of Charged Particles", Academic Press 1987, beschrieben.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren bereit zu stellen, das in der Lage ist, Informationen über die Masse einer Substanz und über den Entstehungsort der Ionen voneinander zu trennen und auszuwerten.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren, welches
1. aus den zu untersuchenden Proben nach der Aufnahme der massenspektrometrischen Daten automatisch Signale in
Form von Molekülmassen auswählt und zu zweidimensionalen Verteilungsbildern verarbeitet, wobei die Proben während der Aufnahme der massenspektrometrischen Daten nach dem Fachmann bekannten Verfahren gerastert werden,
und
2. für jeweils eine ausgewählte Molekülmasse die exakten
Flugzeiten aus den Rohdaten ermittelt und deren Abweichungen von dem berechneten Mittelwert bildlich als Hö- heninformation berechnet, wobei unter Rohdaten solche
Daten verstanden werden, die unmittelbar aus der massenspektrometrischen Analyse hervorgehen, und das in der Lage ist, die berechneten Höheninformationen bildlich darzustellen, beispielweise durch farbliche Kodierung.

3. Wahlweise eine anschließende Rückführung der bildlichen Darstellungen der Höheninformationen auf die ihnen zu
Grunde liegenden Massenspektren.

Im Einzelnen führt das erfindungsgemäße Verfahren dabei nacheinander folgende Schritte aus:
1.1. Erzeugung von massenspektrometrischen Rohdaten
nach einem dem Fachmann bekannten Verfahren, das
Bestandteil aller kommerziell erhältlichen Mas- senspektrometer ist, wobei unter Rohdaten solche
Daten verstanden werden, die nach dem Fachmann bekannten Verfahren unmittelbar aus der massenspektrometrischen Analyse hervorgehen. Die
Flugzeiten der detektierten Ionen und die zugehö- rigen Verhältnisse der Massen zu den Ladungen stehen dabei in einer quadratischen Beziehung zueinander, entsprechend der vereinfachten Beziehung
t = a + b * (m/z)1/2
mit
t = Flugzeit des Ions
a,b = Kalibrierungskonstanten
m = Masse des detektierten Ions
z = Ladungszahl des detektierten Ions
1.2. Berechnung von Massenzentroiden und Peakflachen
mindestens eines oder mehrerer massenspektrometri- scher Signale aus den massenspektrometrischen Rohdaten mit Hilfe von dem Fachmann bekannten Verfahren, die Bestandteil kommerziell erhältlicher Mas- senspektrometer sind. Dabei bestimmen die dem
Fachmann bekannten Verfahren zuerst das Maximum
sowie die rechte und linke Grenze jedes Peaks,
dessen Massenzentroid zu bestimmen ist. Hierfür
werden die ersten und zweiten Ableitungen der
Gleichung t = a + b * (m/z ) 1/2
nach (m/z) gebildet. Das Maximum dieser Gleichung wird nach bekannten Verfahren ermittelt, indem
derjenige Ordinatenwert ermittelt wird, dessen
erste Ableitung Null und dessen zweite Ableitung
ungleich Null ist. Als linke und rechte Peakgrenze werden diejenigen Abszissenwerte festgelegt, deren erste Ableitung ein Maximum und deren zweite Ableitung Null ist, wobei zwischen diesen beiden Ma- xima der ersten Ableitung diejenige Nullstelle der ersten Ableitung liegen muss, die zuvor als Nullstelle des Peakmaximums bestimmt wurde. Anschließend wird zwischen der so ermittelten linken und
rechten Peakgrenze eine Grundlinie gezogen und der Flächenschwerpunkt der oberhalb dieser Grundlinie liegenden Peakflache bestimmt. Das Massenzentroid ergibt sich als Linie, die senkrecht zur Abszisse und durch den Flächenschwerpunkt verläuft .
1.3. Erzeugung einer Datenmatrix, indem jedem detek- tierten massenspektrometrischen Signal die errechneten Massenzentroide, Peakflachen und x,y- Ortskoordinaten zugeordnet werden, wobei die x,y- Ortskoordinaten Teil der Rohdaten sind, die von
dem Fachmann bekannten Verfahren während mas- senspektrometrischer Analysen gespeichert werden, sofern die zu untersuchende Probe während der Aufnahme des Massenspektrums gerastert wird.
1.4. Für jeden interessierenden Massenbereich wird eine Häufigkeitsverteilung berechnet, indem dieser Mas- sebereich beginnend bei der Masse Null in äquidis- tante Massenintervalle von beispielsweise 0.1 Masseneinheiten unterteilt wird. Unter Häufigkeitsverteilung wird dabei eine Darstellung verstanden, in der jedem Pixel, dessen zugehörige Peakintensi- tat im Massenspektrum hinreichend groß war, um
entsprechend der Nachweisgrenze des Massenspektro- meters als Peak erkannt zu werden, die Häufigkeit 1 zugeordnet wird. Unter Pixel werden dabei die
karthesischen x,y-Koordinaten des Herkunftsortes
jedes Ions verstanden. Für jedes Massenintervall
wird die Anzahl derjenigen Pixel des Rasterbereiches gezählt, die im jeweiligen Massenintervall
einen Peak aufweisen. Die so ermittelten Häufig- keiten für die einzelnen Massenintervalle werden
in einem Histogramm als Anzahl der Signale gegen
die jeweils zugehörige Masse aufgetragen.
1.5. In der Häufigkeitsverteilung werden automatisch
Signale (Peaks) nach vorher festgelegten Krite- rien, wie beispielsweise der Häufigkeit oder mittleren Signalintensität der detektierten Massen,
ausgewählt. Die Maxima und / oder rechten und linken Peakgrenzen und / oder Zentroide dieser besonders häufig auftretenden und / oder besonders sig- nalintensiven Massen werden dann wie unter 1.2 beschrieben für diese Häufigkeitsverteilung
(Histogramm) berechnet. Alternativ wird eine feste Varianz für die Festlegung der Maxima und
Peakgrenzen gewählt. Bei Wahl einer festen Varianz wird das Maximum bestimmt, indem die größte Anzahl der Signale, die innerhalb der gesamten Verteilung eines Häufigkeitspeaks auftreten, als Maximum angenommen wird. Die Peakgrenzen werden anschließend so festgelegt, dass mindestens 90 % der Verteilung des Häufigkeitspeaks innerhalb dieser Peakgrenzen liegen und gleichzeitig keine Überschneidung mit
den Signalen eines Nachbarpeaks auftritt.
1.6. Die mittleren Massen der unter 1.5 ausgewählten
Häufigkeitspeaks werden bestimmt, indem der ge- wichtete Mittelwert aller in den Grenzen eines
Häufigkeitspeaks auftretenden, detektierten Peaks aus den zugehörigen Rohdaten errechnet wird, indem die erkannten Peakflächen dieser Signale, multip- liziert mit ihrer jeweiligen bestimmten Masse,
aufaddiert und die Summe dieser Produkte durch die Gesamtfläche aller verarbeiteten Signale geteilt
wird.
2.1. Für jedes Pixel des gerasterten Bereiches wird für eine ausgewählte mittlere Masse die jeweilige Intensität des Signales aus der entsprechenden
Peakflache des Massenspektrums bestimmt. Diese
Kombination aus Orts- und Masseninformation kann
zur Erzeugung zweidimensionaler Bilder genutzt
werden, indem die Intensitäten beispielsweise in 8

Bit- oder 16 Bit- Graustufenwerte übersetzt werden. Dabei ist es vorteilhaft, eine Skalierung zu wählen, die den Graustufenbereich optimal ausnutzt. Es kann wahlweise eine gemeinsame Skalie- rung für alle erzeugten oder einen Satz ausgewählter Bilder gewählt werden, die eine größtmögliche Kontrastbildung ergibt, oder es wird eine individuelle Skalierung für jedes einzelne Bild durchgeführt, um eine maximale Kontrastbildüng und Er- kennbarkeit von Informationen für jedes Einzelbild ergibt .
2.2. Um Höheninformationen zu erhalten, wird für jedes Pixel des gerasterten Bereiches eine mittlere Masse ausgewählt und die zugehörige Ionenflugzeit aus der unter 1.3 aufgeführten Datenmatrix bestimmt.
Die Differenz dieser Flugzeit zur zugehörigen
Flugzeit des Massenschwerpunktes wird berechnet
und als relative Höheninformation dieses Pixels
und des ausgewählten Massensignals gespeichert.

Die ermittelten Höheninformationen werden gemeinsam mit der Ortsinfomation des Pixels (x,y- Richtung) , mittlerer Masse und Signalintensitäten aller ausgewerteten Pixel aller ausgewerteten
Histogramme als fünfdimensionale Datenmatrix gespeichert .
Die gewonnene Höheninformation kann in Graustufenoder Farbkodierungen übersetzt werden, wobei die
Graustufen- oder Farbskala möglichst vollständig
ausgenutzt wird. Dabei kann entweder eine gemeinsame Skalierung für alle erzeugten oder für einen Satz ausgewählter Bilder verwendet werden, oder es wird eine individuelle Skalierung für jedes einzelne Bild durchgeführt, wobei die individuelle
Skalierung zu einer maximalen Kontrastbildung und

Erkennbarkeit der Informationen führt. Im Falle
der Verwendung einer Graustufenskala werden beispielsweise 8 Bit- oder 16 Bit-Graustufenskalen
verwendet, Farbkodierungen beispielsweise 24- oder 48 Bit-RGB-Kodierungen.
2.3. Um eine größere Genauigkeit der Bestimmung des Hö- henprofiles zu erreichen, können die Höheninformationen ausgewählter Graustufenbilder gemittelt
werden. Hierzu werden die berechneten Flugzeitun- terschiede zunächst in massenunabhängige Energievariationen zurückgerechnet. Diese Energievariationen werden aus den verschiedenen Bildern für jedes Pixel gemittelt und in ein Gesamt -Höhenbild
übertragen.
2.4. Zur Kalibrierung der Probenhöhe werden die ermittelten Flugzeitunterschiede in massenunabhängige
Energievariationen zurückgerechnet. Diese Energievariationen werden in Beziehung gesetzt zur kinetischen Energie der Ionen nach Durchlaufen der ersten Beschleunigungszone sowie zur Länge dieser
Beschleunigungszone. Die Energievariationen werden auf diese Weise in eine entsprechende Strecke umgerechnet, die der Höhe der startenden Ionen über
der Probentellerebene entspricht. Dabei gilt:
h = s * (1-Ekin * / e * Ul)
mit
s = effektive Beschleunigungsstrecke des ersten
elektrischen Feldes
h = Probenhöhe
Ekin = kinetische Energie der Ionen (aus Messdaten
ermittelt)
e = Elementarladung
Ul = Spannung der ersten Beschleunigungsstrecke
Da die Strecke s als effektive Beschleunigungs- strecke wegen der Verwendung inhomogener elektrischer Felder nicht unmittelbar aus den Gerätedimensionen ablesbar ist, wird eine
Kalibrierungsfunktion der Form
H = a + b * Ekιn
verwendet mit a,b = Kalibrierungskonstanten.
3.1. Aus den gespeicherten Daten lässt sich für jedes
zwei- oder dreidimensionale Bild das Massenspektrum
für jedes abgebildete Pixel anzeigen, da es aus der
fünfdimensionalen Datenmatrix jedes Pixels zugänglich ist .

Dem Fachmann ist bekannt, dass die massenspektrometrische Auflösung in z-Richtung durch den Fokusdurchmesser oder die Tiefenschärfe beeinflusst wird. Bei der vorliegenden Erfindung werden Fokusdurchmesser verwendet, deren laterale Auflösung in x,y-Richtung einen um ein bis zwei Zehnerpotenzen größeren Wert besitzt als die Höhenauflösung. Bevorzugt wird bei der vorliegenden Erfindung mit lateralen Schrittweiten des Verschiebetisches kleiner oder gleich 100 μm gearbeitet. Dabei ergeben sich unter Nutzung des erfindungsgemäßen Auswerteverfahrens Höhenauflösungen (Auflösungen in z-Richtung) zwischen 0,1 μm und 200 μm (optimiert ergeben sich Höhenauf-lösungen 0,1 μm bis 10 μm) .

Zur Probenvorbereitung wird eines der dem Fachmann bekannten Präparationsverfahren der Massenspektrometrie verwendet.

Die zu untersuchende Probe wird auf einem dem Fachmann bekannten kommerziell erhältlichen Verschiebetisch befestigt, der eine für die Aufgabenstellung hinreichende laterale Auflösung aufweist (Bereich von 1 nm bis 10 mm, bev. 1 nm bis 100 μm) .
Dem Fachmann ist bekannt, dass es ebenso möglich ist, das vorgestellte Konzept mit einer relativen Bewegung des Lasers zum Verschiebetisch zu realisieren.

Die vorliegende Erfindung eignet sich für alle Methoden zur Ionisierung von Oberflächen (Desorptionsverfahren) , beispielsweise für LDI (Laser-Desorption-Ionisierung) , LAM-MA/LAMMS/LIMA/LIMS (Laser-induzierte Massenspektrometrie) , SIMS, PDMS (Plasma-Desorptions-Massenspektrometrie) , MALDI (Matrix-asistierte Laserdesorption-Ionisierung) und SIMS (Sekundärionen-Massenspektrometrie) . Als Strahlungsquelle können im UV- und / oder im IR-Bereich emittierende Laser verwendet werden. Um eine hohe Fokussierbarkeit zu erreichen, werden bevorzugt im UV-Bereich emittierende Laser verwendet, beispielsweise ein ND:YLF-Laser (Neodym-Yttrium-Lithium-Fluorid-Laser) mit einer Emissionswellenlänge λ = 262 nm für optmierte Fokussierungsbedingungen oder ein N-Laser mit λ = 337 nm für optimierte MALDI-Bedingungen. Für massenspektro-metrische Imaging-Verfahren, d.h. bildgebende Verfahren, die die Darstellung von Mengenangaben beinhalten, können des weiteren auch dem Fachmann bekannte, im IR-Bereich emittierende Laser eingesetzt werden, beispielweise für die Untersuchung der Oberflächeneigenschaften biologischer Proben.

Es können dem Fachmann bekannte Massenanalysatoren verwendet werden, die in der Lage sind, die kinetische Energie der erzeugten Ionen zu analysieren und auszuwerten, beispielsweise :
TOF-Massenanalysatoren (Time of Flight- Massenanalysatoren, d.h. Flugzeit-Massenanalysatoren) , Sektorfeldgeräte, die den elektrischen Sektor als Ener- gieanalysator verwenden und damit die Probenhöhe in eine unterschiedliche Ablenkung transformieren, die von einem ortsauflösenden Detektor gemessen werden kann,
- Quadrupol-, Ionenfallen- und Ionencyclotron- Massenspektrometer, denen einer der kommerziell erhältlichen und dem Fachmann bekannten Energieanalysatoren vorgeschaltet wird, der die entstehenden Energieunterschiede auflösen kann.

Es können dem Fachmann bekannte Ionendetektoren verwendet werden, die eine zeitliche Auflösung des Ionensignals aufweisen, die größer als die sich ergebenden Gesamtflugzeitände-rungen ist. Hierzu zählen beispielspielsweise Mikrokanalplat-ten, Microsphere Plates und Sekundärelektronenvervielfacher.

Beispiele

Ein Probengemisch, das 2 , 5-Dihydroxybenzoesäure (DHB) , Substanz P (ein Peptid) , Melittin und Insulin enthielt, wurde mittels SMALDI-Flugzeit-MS untersucht. Die Probenmatrix bestand aus DHB.

1. Bestandteile der Messeinrichtung
Verwendet wurde eine Messeinrichtung, bestehend aus einem Massenspektrometer „LAMMA 2000" (Fig. 3) , das die erfindungsgemäße Ionenquelle und die nachfolgend aufgeführten kommerziell erhältlichen Teile enthielt, sowie dem erfindungsgemäßen Auswerteverfahren:
einem Stickstofflaser (N2-Laser) : VSL 337 ND-Laser (Laser Science Inc., Cambridge, Massachusetts, USA), λ = 337 nm, Pulswiederholungsrate 10 Hz, Pulsdauer 3 ns, laterale Auflösung = Fokusdurchmesser des Laserstrahls: 0.6-1.5 μm X-Y-Z-Piezotisch 21 (Graf Mikrotechnik, Wertingen) , auf dem die Probe befestigt wurde und durch dessen Verschieben die Probe bei ortsfestem Laserstrahl gerastert wurde. Vor

Messbeginn wurde der Verschiebetisch zur einmaligen Fokussierung der Probe ein Mal in z-Richtung bewegt. Während der Messung erfolgte die Bewegung nur in x- und y- Richtung. Rasterweite: 100 μm x 100 μm, minimale Schritt- weite 0.25 μm
Mikroprozessorsystem zur Kontrolle des Verschiebetisches

(Motorola 68000 Mikroporzessor, Motorola Inc., Schaumburg,

Illinois)
Vakuumpumpen: Ölrotationspumpe zur Erzeugung des Vorvaku- ums (Pumpleistung 16m3/h, Leybold AG, Köln) , Turbomolekularpumpe zur Erzeugung des Hochvakuums (360 1/s, Leybold AG, Köln) , Druck in der Vakuumkammer nach Auspumpen ca. 5*10"7 mbar 2. Scannen der Probe
Scanbereich: 100 μm x 100 μm
Scanschrittweite: 1 μm
Scangeschwindigkeit: 10 Pixel pro Sekunde
10000 Massenspektren pro Pixel

3. Ionenquelle
Die beschriebenen drei Anforderungen "räumliche Fokussierung", "zeitliche Fokussierung" und "Höhendetektion" wurden erfüllt durch Kombination von Abständen, Öffnungsdurchmessern und elektrischen Potentialen. In einer beispielhaften Ausführung wurde ein Abstand zwischen Lochblende und Probenoberfläche von 3.9 mm gewählt. Die Lochblende hatte einen Öffnungs-durchmesser von 7 mm. Die weiteren gewählten Abstände waren: - Lochblende-Gitter: 8.6 mm,
Gitter-Ionenführungskanalöffnung: 1.9 mm,
Ionenführungskanalöffnung - Feldabschlußgitter vor Detektor: 1306 mm und
Feldabschlussgitter - Detektoroberfläche: 20 mm.
Der Ionenführungskanal hatte eine Öffnung mit 4mm Durchmesser (Innenmaß) , der sich konisch über eine Strecke von 8 mm auf ein Innenmaß von 6 mm erweiterte. Der Detektor war eine Doppel-Mikrokanalplatte mit einem aktiven Durchmesser von 40 mm.

Nach Optimierung bezüglich der drei genannten Anforderungen wurden geeignete Potentiale ermittelt:
Lochblende: festgelegt auf +10000 V,
Probenteller: +13261 V,
- Gitter: -1810 V,
Detektoroberfläche: -1850 V,
Ionenführungskanal, Flugrohr und Feldabschlussgitter lagen auf Massepotential (0V) .

4. Vo fokussierung
Der Laserstrahl wurde außerhalb des Vakuums im Submikrometer-bereich vorfokussiert . Hierfür wurden dem Fachmann bekannte Suprasil®-Quarzlinsen zur Vorfokussierung mit astigmatischer Korrektur 24 eingesetzt, die den Laserstrahl auf etwa 10 μm vorfokussierten.

5. Verwendung eines Nd:YLF-Lasers
Alternativ zum Stickstofflaser (N2-Laser) kann ein Nd:YLF-Laser, beispielsweise Model 421 QD (ADLAS, Lübeck) verwendet werden, Ausstoßenergie 100 μj pro Nanosekundenpuls bei 524 nm. Eine Vervierfachung der Frequenz dieses Lasers wird extern durch einen Temperatur-gesteuerten BBO-Kristall (Bariumbetaborat zur Erzeugung der zweiten nichtlinearen Ober-Schwingung) erreicht. Die endgültige Pulsenergie beträgt ca. 15 μJ bei 262 nm. Der Strahl des Nd: YLF-Lasers besitzt nach Vervierfachung durch den BBO-Kristall eine streng elliptische Form 30. In diesem Fall ist eine spezielle optische Korrektur erforderlich, um eine hohe numerische Apertur am Eingang der fokussierenden Objektivlinsen sicher zu stellen. Das Verhältnis von großem und kleinem Durchmesser der Ellipse beträgt bei Verwendung dieses Lasers etwa 1:8. Nach Vorfokussierung mit einer spärischen Linse füllt der Strahl deshalb nur in der Eingangslinse des Fokussierungsobjektivs einen schmalen Streifen aus. Aus diesem Grunde wurde eine spezielle optische Einheit für die Zirkularisierung entwickelt, die die beiden Strahlachsen unterschiedlich vorfokussiert (siehe Fig. 4) . Bei der x-Achse handelt es sich um die kleine, bei der y-Achse um die große Ellipsenachse. Beide Achsen werden durch zylindrische Linsen 27 und 28 fokussiert, wobei beide eindimensionalen Foci auf dieselbe Brennebene justiert werden und auf diese Weise ein kreisförmiges Strahlenprofil 31 erhalten wird. Die Vorfokussierung des Nd: YLF-Laserstrahls wurde bereits von Spengler und Hubert publiziert (B. Spengler und M. Hubert, Scanning Microprobe matrix-Assisted Laser Desorp-tion Ionization (SMALDI) Mass Spectrometry: Instrumentation for Sub-Micrometer Resolved LDI and MALDI Surface Analysis, Journal of the American Society of Mass Spectrometry 2002, 13, 735-748) .

6. Peakerkennung und statistische Auswertung
Die erhaltenen Einzelspektren pro Probenposition wurden summiert, anschließend wurden die Zentroide 34 berechnet und Masse, Peakflächen 33 und Ortskoordinaten zugeordnet (vgl.

Fig. 6) . Danach wurde die Häufigkeitsverteilung aller detektierten Massen bestimmt. Im Histogrammm wurden die Maxima bestimmt und die Massenfenster für die Bilder fest gelegt (vgl. Fig. 7) . Für jedes Bild wurde der Massenschwerpunkt 35 durch Gewichtung der Einzelmassen mit den Peakflächen berechnet, und es wurde die relative Messunsicherheit 36 ermittelt (vgl. Fig. 8) .

7. Bilderstellung
Die Peakflächen jeder detektierten Masse wurden mit Hilfe des erfindungsgemäßen Auswertungsprogramms in 16 Bit Graustufen umgerechnet. Dabei wurde die gesamte Gruppe von Bildern auf maximalen Kontrast skaliert, um alle von DHB, Substanz P, Melittin und Insulin erhaltenen Bilder miteinander verglei-chen zu können. Parallel dazu wurden Einzelbilder skaliert, um einen maximalen Kontrast für die Verteilung jeder einzelnen Substanz zu bekommen (vgl. Fig. 10, obere Reihe) .

8. Berechnung und Darstellung der Höheninformation
Die Höheninformationen zu jedem zu einem Bild verarbeiteten

Massensignal wurden mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens ermittelt. Für jeden Bildpunkt wurden die Differenzen zwischen der erwarteten Flugzeit des Massenschwerpunktes und der tatsächlichen Flugzeit des bei der Bilderstellung (siehe 4) zugeordneten Massensignals aus der zuvor ermittelten
Datenmatrix (siehe 3) berechnet. Den Höheninformationen wurden sodann Farbkodierungen der Pixel des Höhenbildes zugeordnet. Dabei wurde die Farbe Rot für eine große Höhe innerhalb des Bildes, Grün für mittlere Höhe, Blau für Probenträgerebene und Schwarz für fehlendes detektiertes Signal gewählt. Alternativ wurde die Höheninformation als 16 Bit Graustufen berechnet (vgl. Fig. 10, untere Reihe) . Weiß repräsentiert dabei große Höhe, Grau mittlere Höhe und
Schwarz Probenträgerebene und fehlendes detektiertes Signal. Zusätzlich wurden in einer weiteren Darstellungsform die Signalintensitäten neben den Höheninformationen dargestellt. Dazu wurden wie oben beschrieben die Höhenwerte als Farbwerte kodiert, sowie die Intensitätswerte als Helligkeitswerte wie in Abschnitt 3 (Bilderstellung) kodiert.

9. Rückführung
Mit Hilfe von dem Fachmann bekannten Auswertungsverfahren wurde jeder Bildpunkt [x;y] den zu Grunde liegenden Einzel-Spektren zugeordnet (vgl. Fig. 12) .

10. Alternatives Scannen der zu untersuchenden Probe
Der X-Y-Z-Verschiebetisch wurde in diesem Versuch nicht bewegt, sondern der Laser wurde relativ zum Verschiebetisch bewegt. Es wurde ein Laser mit einem Fokusdurchmesser von 0,3 μm bis 0,6 mm verwendet, die Scanschrittweite betrug ebenfalls 1 μm (ohne Abbildung) .

Bezugszeichenliste

olgenden sind 12 Zeichungen aufgeführt.

Probenträger mit zu untersuchende Probe
Lochblende
Gitter
Linse
Ionenführungskanal
Flugrohr mit Vakuumgehäuse
Feldabschlussgitter
Detektor
Öffnungswinkel des fokussierten Laserstrahls
linke und rechte obere Halterung
Bohrung der Lochblende
linke und rechte untere Halterung
Öffnung des Ionenkanals
Durchmesser der Lochblende
Abstand zwischen Gitter und Lochblende
ionenoptische Anordnung
innerer Abstand zwischen linker und rechter unterer bzw, oberer Halterung
Trajektorie der Ionenbahnen
Abstand zwischen Gitter und Öffnung des Ionenkanals

Objektiv mit zentraler Bohrung
X-Y-Z-Piezotisch und X-Y-Z-Schrittmotortisch
Laser
CCD-Kamera (Charge Coupled Device-Kamera)
Vorfokussierung mit astigmatischer Korrektur
Dichroitische Spiegel
Lichtquelle für Probenbeobachtung
zylindrische Linse y
zylindrische Linse x
Vorfokus elliptisches Strahlprofil vor Fokussierung
kreisförmiges Strahlprofil nach Fokussierung
Basislinie
Peakflache
Zentroide
Maximum der Häufigkeitsverteilung aller Bildpunkte relativer Variationsbereich durch Höhenunterschiede

Fig . 1 :
Der Laserstrahl wird durch eine Linse oder ein Linsensystem 4 mit einem Öffnungswinkel 9 auf die Probenoberfläche 1 fokussiert. Die von der zu untersuchenden Probe 1 emittierten Ionen werden durch eine Lochblende 2, ein Gitter 3 und einen Ionenführungskanal 5 zeitlich und räumlich fokussiert. Anschließend fliegen sie durch den Ionenführungskanal 5 und das Flugrohr 6 zum Detektor 8. Das Feldabschlussgitter 7 schirmt das elektrische Potential des Detektors 8 gegen die feldfreie Flugstrecke ab.

Fig. 2:
Die ionenoptische Anordnung besteht aus einer Lochblende 2 und einem metallischen Gitter 3. Der Laserstrahl wird mit einem Öffnungswinkel 9 auf die Probenoberfläche fokussiert und erzeugt dort Ionen, die durch das elektrische Feld zwischen Probenträger und Lochblende 2 durch die Bohrung der Lochblende 2 (Öffnungsdurchmesser 14) beschleunigt werden. Eine zweite Beschleunigung erfolgt durch das elektrische Feld zwischen Lochblende 2 und Gitter 3 (Abstand 15) , sowie eine richtungsgebende Abbremsung durch das elektrische Feld zwischen Gitter 3 und Öffnung des Ionenführungskanals 13 (Abstand 19) . Die Ionen fliegen sodann durch den lonenfüh-rungskanal 5 und das Flugrohr zum Detektor. Die Lochblende und das Gitter werden gehalten durch linke und rechte obere bzw. untere Halterungen 10 und 12 (innerer Abstand 17) .

Fig. 3:
Der Laserstrahl 22 wird nach astigmatischer Korrektur und Vorfokussierung 24 und Umlenkung über dichroitische Spiegel

25 durch ein Objektiv mit zentraler Bohrung 20 auf den Piezo-tisch 21 mit der Probe gelenkt. Die emittierten Ionen wandern durch das Flugrohr 6 zum Detektor 8. Licht aus einer Lichtquelle zur Probenbeobachtung 26 wird ebenfalls über dichroi- tische Spiegel 25 auf die Probe gelenkt; eine CCD-Kamera 23 erzeugt dabei optische Bilder des untersuchten Probenbereiches .

Fig. 4:
System aus zylindrischen Linse x 28 und y 27 zur Präfokussie-rung 29 und Zirkularisierung des elliptischen Laserstrahls. In Abhängigkeit vom Radienverhältnis der Ellipsenachsen hat die Linse x dabei eine kleinere Brennweite als die Linse y. Die Abstände der Linsen zum Vorfokus verhalten sich entsprechend. Das elliptische Strahlprofil 30 wird durch die Fokussierung zum zirkulären Strahlprofil 31.

Fig. 5:
Intensitätsverteilung eines fokussierten Nd:YLF-Laserstrahls . Die Frequenz wurde auf eine Wellenlänge von 262 nm vervierfacht und die Intensitätsverteilung nach 100-facher Vergrößerung mit einem Diodenarray gemessen; der Abstand der Dioden betrug 15 μm. Jeder Datenpunkt entspricht der Lichtintensi-tat, die von einer einzigen Diode gemessen wurde. Der Fokusdurchmesser wurde zu (0.45 + 0.15) μm ermittelt.

Fig. 6:
Lichtoptische Mikroskopaufnahme eines Substanzgemisches, das 2 , 5-Dihydroxybenzoesäure (DHB), Substanz P, Melittin und Insulin enthielt. Der mit einem weißen Quadrat markierte Bereich von 100 μm x 100 μm wurde mittels Scanning Microprobe MALDI (SMALDI) -Flugzeit-MS untersucht (gerastert). Hierzu diente ein Hochfrequenz-Piezotisch mit einer Rasterweite von 100 μm x 100 μm und einer minimalen Schrittweite von 0.25 μm.

Die laterale Auflösung, d.h. der Fokusdurchmesser, betrug 0.7 μm, so dass bei einer gewählten Schrittweite von 1 μm genau 10000 Bildpunkte des gerasterten Bereiches erzeugt wurden. Jeder Rasterpunkt kann mehrfach gemessen werden, wobei die Einzelspektren zu einem Summenspektrum gemittelt oder einzeln ausgewertet werden können. Im Beispiel wurden Einzelspektren verwendet. Anschließend wurden die Signalintensitäten aller detektierten Ionensignale mit Hilfe des erfindungsgemäßen Auswertungsverfahrens in laterale Verteilungsbilder umgerechnet (vgl. Fig. 10 bis Fig. 12) .

Fig. 7:
Die Oberfläche eines Substanzgemisches, das Substanz P, Melittin, 2 , 5-Dihydroxybenzoesäure (DHB) und Insulin enthielt, wurde mittels SMALDI-Flugzeit-MS untersucht (vgl. Fig. 6) . Fig. 7 zeigt die Darstellung des 1. Schritts der Peaker-kennung. Nach Festlegung der Basislinie 32 eines Peaks werden die Peakflache 33 und die Zentroide 34 berechnet.

Fig. 8:
Ein Substanzgemisch, das 2 , 5-Dihydrobenzoesäure (DHB), Substanz P, Melittin und Insulin enthielt, wurde mittels SMALDI-Flugzeit-MS untersucht (vgl. Fig. 6) . Dabei wurde eine Fläche von 100 μm x 100 μm gerastert; die Auflösung betrug 1 μm.

Fig. 8 stellt ein Histogramm aller Signale dar. Anhand dieses Histogramms wurden die Häufigkeitsverteilung aller detektierten Massen sowie die Maxima bestimmt, um geeignete Massenfenster festzulegen.

Fig. 9:
Berechnung des Massenschwerpunktes für ein Bild durch Gewichtung der Einzelmassen mit den Peakflächen. Dargestellt sind ein Ausschnitt des Histogramms (Fig. 8) sowie die Berechnung des Massenschwerpunktes des Molekülions von Melittin. Am

Maximum 35 wurden 122 Signale im Bereich von 2848,80 u und 2848,89 u ermittelt. Der relative Variationsbereich durch Höhenunterschiede (relative Messunsicherheit) 36 wurde zu 0.003 berechnet. Die Bestimmung des Variationsbereiches dient zur Festlegung des Kodierungsbereiches für die Höhendarstellung. Die mittlere Masse für das Molekülion von Melittin wurde zu 2848.53 u ermittelt.

Fig. 10:
Für jeden bestimmten Massenschwerpunkt von DHB, Substanz P, Melittin und Insulin (vgl. Fig. 6 bis Fig. 9) wurde seine zugehörige Peakflache in 16 Bit Graustufen umgerechnet, obere Reihe der Abbildungen: Die gesamte Gruppe von Bildern wurde gemeinsam auf maximalen Kontrast skaliert und und stellt die Intensität der Signale in X- und Y-Richtung als Graustufenabbildung dar.
untere Reihe der Abbildungen: Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Auswertungsverfahrens wurde die gewonnene Höheninformation für alle Signale oberhalb der Peakerkennungsschwelle der

Signalintensität in Y- und Y-Richtung als Graustufenabbildung graphisch dargestellt. Weiße Punkte bedeuten dabei maximale Höhe des Ionenentstehungsortes oberhalb des Probentellers, graue Punkte bedeuten mittlere Höhe und schwarze Punkte bedeuten Probentellerebene oder fehlende Signalintensität.

Fig. 11:
Darstellung der durch automatische Bildverarbeitung ohne Pre- Scan bzw. ohne Vorgabe von Massen erhaltenen Abbildungen der Oberflächenverteilungen von DHB, Substanz P, Melittin und

Insulin sowie von verschiedenen Isotopomeren, Derivaten und Anlagerungsprodukten derselben.

Fig. 12:
Zuordnung jedes Bildpunktes [x;y] der Substanz P zu den zu

Grunde liegenden Einzelspektren unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Verfahren zur Datenverarbeitung.