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1. (WO1998003653) METHOD FOR PREPARING TRANSGENIC NON-HUMAN MAMMALIAN ORGANS FOR TRANSPLANTATION TO HUMANS, AND NUCLEOTIDE SEQUENCES THEREFOR
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REVENDICATIONS

1 . Utilisation de séquences nucléotidiques codant pour des anticorps dirigés contre toute molécule impliquée dans un phénomène de rejet de greffe

(encore désignés ci-après anticorps anti-molécules), et notamment contre toute molécule possédant une activité telle que ladite molécule représente un épitope xénoantigénique, ou participe à la biosynthèse d' épitopes xenoantigeniques dans des cellules de mammifères non humains (et plus particulièrement à la surface de ces cellules), ces épitopes étant susceptibles d'être reconnus par des xénoanticorps naturels humains lorsque lesdites cellules, ou organes constitués de ces cellules, de mammifères non humains, sont greffés chez l'homme, pour la préparation de cellules transgéniques, ou organes transgéniques, de mammifères non humains, au sein desquels lesdites molécules forment en totalité ou en partie des complexes immuns avec lesdits anticorps anti-molécules, de telle sorte que l'activité desdites molécules dans les phénomènes de rejet de greffe soit totalement ou partiellement inhibée, en particulier que les xénoanticorps susmentionnés ne reconnaissent plus, en totalité ou en partie, les susdits épitopes, ou au sein desquels la biosynthèse desdits épitopes xenoantigeniques est partiellement ou totalement inhibée, lesdites cellules ou lesdits organes transgéniques de mammifères non humains étant destinés à être greffés chez un patient.

2. Utilisation selon la revendication 1 , de séquences nucléotidiques codant pour des anticorps dirigés contre :
- tout épitope xénoantigénique, glucidique ou non glucidique, reconnu par des xénoanticorps humains, et plus particulièrement les épitopes glucidiques galactosylés situés à la surface des membranes de cellules de mammifères non humains, notamment l'épitope α-galactosyl présent à la surface de cellules de porc et constitué de l'ensemble Galα1 ,3Gal-N-acétyllactosamine susmentionné,

- toute molécule participant à la biosynthèse d 'épitopes xenoantigeniques chez l'homme, de nature glucidique ou non glucidique, et plus particulièrement les galactosyltransférases présentes dans les cellules de mammifères non humains, notamment l'enzyme α1 ,3GT présente dans les cellules de porc,
- toute molécule à caractère inflammatoire synthétisée dans l'endothélium de mammifères non humains, et dont l'activité biologique conduit notamment à la modification des propriétés anticoagulantes de l'endothélium in vivo en milieu xénogénique, telle que les cytokines et chemoattracteurs (IL- 1 , IL-6, IL-8, IP- 10, RANTES, MCP/JE, inhibiteurs pl5E, GM-CSF, G-CSF), les molécules d 'adhésion (ELAM-1 , VCAM-1 , ICAM-1 , c-sis, GPlbα, vWF, ligand LAM-1) les facteurs de transcription ou modifiant la transcription (c-fos, NFkB, Gem), les régulateurs du tonus vasculaire (iNO synthase, PGH synthase, endothéline), les facteurs intervenant dans la coagulation (PAF acétyltransférase, facteur tissulaire, PAI-1), les facteurs d'immunocompétence (CMH I, CMH II),
- les récepteurs membranaires à des molécules présentes chez le receveur, l'action de ces molécules étant dirigée vers un rejet de greffe, dont par exemple le C5aR, ou le TNFαR, ou les récepteurs aux cellules NK.

3. Utilisation selon la revendication 1 ou la revendication 2, de séquences nucléotidiques codant pour des anticorps dirigés contre l'une au moins des isoformes (et avantageusement contre toutes les isoformes) des galactosyl transférases présentes chez les mammifères non humains, et plus particulièrement de l'enzyme α-1 ,3GT présente chez le porc, pour la préparation d'organes de mammifères non humains transgéniques au sein desquels la biosynthèse des épitopes α-galactosyl dans les cellules desdits organes est partiellement ou totalement inhibée.

4. Anticorps, le cas échéant simple brin, dirigés contre l'une au moins des isoformes de l'α-1 ,3GT, et plus particulièrement dirigés contre l'une au moins des isoformes de l'α-1 ,3GT présentes chez le porc et représentées par les séquences en acides aminés SEQ ID NO 2 (correspondant à l'isoforme 1), SEQ ID NO 4 (correspondant à l'isoforme 2), SEQ ID NO 6 (correspondant à l'isoforme 3) et SEQ ID NO 8 (correspondant à l'isoforme 4), ces isoformes 1 à 4 étant respectivement codées par les séquences nucléotidiques représentées par SEQ ID NO 1 , SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 5 et SEQ ID NO 7, ou codées par toutes séquences nucléotidiques dérivées de ces dernières, notamment par dégénérescence du code génétique.

5. Anticorps selon la revendication 4, dirigés contre l'une au moins des isoformes 3 et 4 de l'α-1 ,3GT présentes chez le porc et représentées par les séquences en acides aminés SEQ ID NO 6 et SEQ ID NO 8.

6. Anticorps selon la revendication 4 ou la revendication 5, caractérisés en ce qu'ils sont représentés par les séquences en acides aminés SEQ ID NO 10 (anticorps désigné ScFv1), SEQ ID NO 12 (anticorps désigné ScFv2), SEQ ID NO 14 (anticorps désigné ScFv3), SEQ ID NO 16 (anticorps désigné ScFv4) et SEQ ID NO 18 (ScFv5), ou par toute séquence en acides aminés dérivée de ces dernières, notamment par addition, suppression ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés, ou par tout fragment des séquences susmentionnées ou de leurs séquences dérivées, lesdites séquences et lesdits fragments étant susceptibles de reconnaître l'une au moins des isoformes de l'α-1 ,3GT.

7. Séquences nucléotidiques codant pour un anticorps selon l'une des revendications 4 à 6, et comportant notamment les séquences nucléotidiques représentées par SEQ ID NO 9 (codant pour ScFv1), SEQ ID NO 11 (codant pour ScFv2), SEQ ID NO 13 (codant pour ScFv3), SEQ ID NO 15 (codant pour ScFv4), SEQ ID NO 17 (codant pour ScFv5), ou toute séquence nucléotidique dérivée de ces dernières, notamment les séquences dérivées par dégénérescence du code génétique, et étant néanmoins capables de coder pour les anticorps

ScFv1 , ScFv2, ScFv3, ScFv4 ou ScFv5, ou les séquences dérivées par addition, suppression ou substitution d'un ou plusieurs nucleotides, ou tout fragment des séquences nucléotidiques susmentionnées ou de leurs séquences dérivées, lesdites séquences dérivées et lesdits fragments étant susceptibles de coder pour un anticorps susceptible de reconnaître l'une au moins des isoformes de l'a

1 ,3GT.

8. Vecteur contenant l'une au moins des séquences nucléotidiques selon la revendication 7 et les éléments nécessaires à l'expression des anticorps selon l'une des revendications 4 à 6.

9. Hôte cellulaire contenant l'un au moins des vecteurs selon la revendication 8.

10. Mammifère transgénique non humain, ou cellules de mammifères, comprenant dans son génome au moins une séquence nucléotidique codant pour des anticorps dirigés contre toute molécule impliquée dans un phénomène de rejet de greffe (encore désignés ci-après anticorps anti-molécules), et notamment contre toute molécule possédant une activité telle que ladite molécule représente un épitope xénoantigénique, ou participe à la biosynthèse d'épitopes xenoantigeniques dans des cellules de mammifères non humains (et plus particulièrement à la surface de ces cellules), ces épitopes étant susceptibles d'être reconnus par des xénoanticorps naturels humains lorsque lesdites cellules, ou organes constitués de ces cellules, de mammifères non humains, sont greffés chez l'homme, et plus particulièrement au moins une séquence nucléotidique selon la revendication 7.
11. Mammifère transgénique non humain tel qu'obtenu par introduction, notamment par microinjection, dans un ovocyte fécondé, d'au moins une séquence nucléotidique telle que définie dans la revendication 10, et plus particulièrement de l'une des séquences nucléotidiques selon la revendication 7, et insertion de l'embryon dans la matrice d'une mère de substitution et développement de l'embryon à terme.

12. Mammifère transgénique non humain selon l'une des revendications 10 à 11 , tel que produit par croisement d'animaux transgéniques exprimant au moins une séquence nucléotidique telle que définie dans la revendication 10, et plus particulièrement au moins une des séquences nucléotidiques selon la revendication 7.

13. Cellules cultivées à partir des animaux transgéniques non humains selon l'une des revendications 10 à 12.

14. Organes de mammifères non humains, comprenant dans le génome des cellules les constituant au moins une séquence nucléotidique telle que définie dans la revendication 10, et plus particulièrement au moins une des séquences nucléotidiques selon la revendication 7, tels qu'obtenus par prélèvement sur des mammifères transgéniques non humains selon l'une des revendications 10 à 12.

15. Polypeptide comprenant la séquence d'acides aminés telle que représentée par la SEQ ID NO 6 (correspondant à l'isoforme 3 de l'α1 ,3-GT) ou SEQ ID NO 8 (correspondant à l'isoforme 4 de l'α1 ,3-GT), ou tout polypeptide contenant tout fragment d'au moins environ 6 acides aminés, de l'une des susdites séquences d'acides aminés, ledit polypeptide contenant ce fragment étant susceptible de générer des anticorps reconnaissant l'une au moins des quatre isoformes de l'α-1 ,3GT, ou toute séquence dérivée de ces dernières, notamment par addition, suppression ou modification d'un ou plusieurs acides aminés, sous réserve que la séquence dérivée soit susceptible de générer des anticorps reconnaissant l'une au moins des quatre susdites isoformes.

16. Séquences nucléotidiques comprenant les séquences représentées par SEQ ID NO 5 et SEQ ID NO 7, ou toutes séquences dérivées, notamment par les séquences dérivées par dégénérescence du code génétique, et étant néanmoins capables de coder pour les polypeptides représentés par les séquences en acides aminés représentées par SEQ ID NO 6 et SEQ ID NO 8 respectivement, ou les séquences dérivées par addition, suppression ou substitution d'un ou plusieurs nucleotides, ou tout fragment des séquences nucléotidiques susmentionnées ou de leurs séquences dérivées, lesdites séquences dérivées et lesdits fragments étant susceptibles de coder puis un anticorps susceptible de reconnaître l'un au moins des isoformes de l'α1,3 GT.