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1. (WO1992010761) VERFAHREN UND REAGENZIEN ZUR BESTIMMUNG DER ENZYMATISCHEN AKTIVITÄT VON TRANSGLUTAMINASEN (EC 2.3.2.13)
Anmerkung: Text basiert auf automatischer optischer Zeichenerkennung (OCR). Verwenden Sie bitte aus rechtlichen Gründen die PDF-Version.

Verfahren und Reagenzien zur Bestimmung der enzvmatischen Aktivität
von Transglutaminasen (EC 2.3.2.13)

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine neue Methode zur Bestimmung der Aktivität der Enzyme der Enzymkommisions-Nummer EC 2.3.2.13, insbesondere der Aktivität des Blutgerinnungsfaktors XIII (Plasma-Transglutaminase), sowie ein Reagenzkit zur Durchführung der Bestimπrnnεr.

Die Blutgerinnung ist ein komplexer, in mehreren Phasen ablaufender Vorgang, der durch verschiedene physiologische und pathologische Prozesse ausgelöst werden kann und in vivo vor allem der Blutstillung dient. An der Blutgerinnung sind verschiedene, sogenannte Gerinnungsfaktoren beteiligt. Meist handelt es sich hierbei um Proteasen, die durch hochspezifische proteolytische Wirkung auf andere Gerinnungsfaktoren diese aktivieren, oder um Cofaktoren dieser Reaktionen. Ziel dieser Reaktionen ist die Überführung des Fibrinogens in polymeres Fibrin. Sowohl Fibrinogen wie auch Faktor XIII erfahren durch das Enzym Thrombin, welches im Verlauf der Blutgerinnung aus Prothrombin entsteht, eine proteolytische Abspaltung von Polypeptiden. Nach Abspaltung dieser Polypeptide entsteht aus Fibrinogen Fibrinmonomer, welches spontan polymerisiert. Abspaltung des Polypeptids von der katalytischen Einheit des Faktor XIII bewirkt die Aktivierung des Enzyms. Das katalytisch inaktive Proenzym Faktor XIII findet sich im Blutplasma, sowie in Thrombocyten. Aktiver Faktor XIII katalysiert die Bildung von kovalenten Bindungen zwischen den polymerisierten Fibrinmolekülen und damit eine Erhöhung der mechanischen Resistenz des Fibrins. Zusätzlich werden pathophysiologisch wichtige Moleküle wie Fibronectin und Alpha-2-Antiplasmin kovalent an das Fibringerinnsel gekoppelt. Die Kopplung von Fibronectin ermöglicht das Einwachsen von Zellen in Fibringerinnsel, die Kopplung von Alpha-2-Antiplasmin führt zu einer Erhöhung der Resistenz des Fibrins gegenüber Proteasen wie Plasmin.

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Transglutaminasen finden sich auch in zahlreichen Geweben und Zellen, wie Erythrocyten, Leucocyten, Endothelzellen, Leberzellen, verschiedenen Tumorzellen, etc. Diese intrazellulären Transglutaminasen zeigen ähnliche Spezifität wie Faktor XHI, sind in ihrer Aktivität jedoch nicht thrombinabhängig. Die bekannten Nachweisverfahren zur Messung der Transglutaminaseaktivität sind anhand der Proteintransglu- taminaseaktivität des Faktors XIII entwickelt worden.

Lorand et al. (J. Clin. Invest. 48, Seite 1054 - 1064 (1964) beschreiben einen Test, in dem Faktor XIII mit Thrombin, Glutathion und Calciumchiorid aktiviert und Monodansylcadaverin und gelöstes Casein zugefügt wird. Die Reaktion wird nach 30 Minuten mit Ethanol oder Chloressigsäure abgestoppt, das ausgefallene Protein abzentrifugiert und mehrfach gewaschen, anschließend in einer 8 M Harnstofflösung wieder aufgelöst und die Fluoreszenz des incorporierten Dansyleadaverins gemessen. Die durch die Fällungs- und Waschschritte außerordentlich umständliche Methode wurde später durch Nishida et al. (Thromb. Res. 36, Seite 123 - 131 (1984)) verbessert, indem die Trennung zwischen dem proteingebundenen Dansylcadaverin und dem freien Dansylcadaverin durch Gelfiltration durchgeführt wird. Die Reaktion benötigt aber immer noch einige Stunden und einen relativ hohen Aufwand.

Nach einer etwas abgewandelten Methode läßt sich die Aktivität von Faktor XIII und anderen Transglutaminasen durch Gelelektrophorese auf Agarosegelplatten und anschließender Reaktion mit stark farbigen oder fluoreszierenden Cadaverinderivaten, Casein und Thrombin bestimmen. Auch hier muß durch relativ umständliches Fixieren und Auswaschen das überschüssige Cadaverin aus der Gelplatte entfernt werden. Die Messung erfolgt durch densitometrische Auswertung der Gelplatten (Lorand et al. (Anal. Biochem. 131, Seite 419 - 425 (1983)).

Ein anderes Verfahren mit radioaktiv markierten Aminen wird von Lorand et al. in Anal. Biochem. 50, Seite 623 - 631 (1972) beschrieben, wobei die Reaktionsmischung aus Faktor XIII, Thrombin, Calciumchiorid und einem radioaktiv markierten Amin (Putrescin oder Histamin) nach einer Reaktionszeit von etwa 30 Minuten mit Trichloressigsäure gestoppt und das gefällte Protein mit Filterpapier aufgefangen wird. Gründliche Waschen mit Trichloressigsäure, Ethanol und Aceton beseitigt weitge hend die nicht reagierten radioaktiven Amine und erlaubt an der Rest radioaktivität den Gehalt an Faktor XIII zu bestimmen.

Ein anders verlaufendes Verfahren wird von Mousli et al. in Clin. Chem 23/9, Seite 39 - 43 (1977) beschrieben. Das Verfahren nutzt die Tatsach aus, daß bei der durch Transglutaminase, in diesem Falle thrombinak tiviertem Faktor XIII, katalysierten Reaktion zwichen der freien Amino gruppe des proteingebundenen Glutamins und der freien Aminogrupp des Lysins Ammoniak frei wird, welches mit einem Kationenaustausche gebunden und so von der übrigen Lösung getrennt wird, um es an schließend nach Berthelot zu bestimmen. Auch diese Reaktion ist relati umständlich und durch den ungenauen Ammoniaknachweis an Mikromethode nicht sehr geeignet.

Eine wesentliche Verbesserung bringt der von Velasco beschriebene Tes (Biochem. Biophys. Res. Commun. 152, Seite 505 - 511 (1988)). Gemäß dieser Methode wird Dansylcadaverin unter Katalyse von Faktor XIII an N,N'-Dimethylcasein gebunden und die calciumabhängige Reaktion gestoppt, indem eine aliquote Menge des Reaktionsgemisches in eine EDTA-haltige Microtiterplatte überführt wird. Ein Teil des Proteins wird an die Oberfläche der Microtiterplatte adsorbiert und vom Überstand durch Abgießen und Wachen getrennt. Freie Bindungsflächen der Microtiterplatte, welche nicht durch Protein belegt sind, werden anschließend durch Milchproteine blockiert und dann ein monoclonaler Antikörper gegen die Dansylgruppe zugegeben. Nach Auswaschen überschüssigen Antikörpers wird ein weiterer Antikörper gegen Epitope des ersten Antikörpers hinzugegegen, welcher mit Peroxidase markiert ist. Nach weiteren Waschschritten wird durch Zugage von Peroxidase-Reagenz (Farbstof und Wasserstoffperoxid) die Peroxidaseaktivität gemessen, die letztlich einen Rückschluß auf die Transglutaminaseaktivität der ursprünglichen Probe erlaubt. Nachteilig an diesem Verfahren ist die große Anzahl der Wach- und Umsetzungsschritte.

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Ein ähnliches Verfahren wird von Lee et al. (Clin. Chem. 34/5, Seite 906 - 910 (1988)) beschrieben, wobei Citratplasma mit Bentonit inkubiert wird, um Fibrinogen zu entfernen und der Überstand auf eine Microtiterplatte übertragen wird und mit Thrombin inkubiert wird. Danach wird eine Lösung von Calciumchiorid, N,N'-Dimethylcasein und Biotinamidopentyl- amin zugefügt. Die Reaktion wird mit EDTA gestoppt und zur Insolubili- sierung eine aliquote Menge auf eine andere Microtiterplatte übertragen. Nach dem Waschen wird eine Streptavidin-ß-Galactosidaselösung zugefügt. Die adsorbierte Galactosidaseaktivität wird durch die Freisetzung von p-Nitrophenol aus p-Nitrophenyl-ß-D-galactopyranosid bestimmt und bildet ein Maß für die Konzentration des Faktors XIII. Auch diese Methode ist noch sehr aufwendig und durch die verschiedenen Übertragungsschritte ungenau.

Es bestand daher die Aufgabe, eine einfaches, mit möglichst wenigen Reagenzien und Reaktions- und Waschschritten auskommendes analytische Verfahren zur Bestimmung des Blutgerinnungsfaktors XIII (Plasma-Transglutaminase und Thrombocyten-Transglutaminase) und anderer Transglutaminasen der Enzymgruppe EC 2.3.2.13 zu finden, das möglichst automatisierbar und von ungeschulten Fachkräften durchführbar ist.

Die Lösung dieser Aufgabe ist in dem Hauptanspruch wiedergegeben. Die Unteransprüche dienen zur Förderung dieses Verfahrens.

Dadurch, daß die Micro titerplatten zunächst mit dem Protein oder Polypeptid, vorzugsweise mit Casein belegt werden, kann dieses in optimaler Konzentration eingesetzt werden, so daß alle aktiven Stellen der Microtiterplatte, an die sich solche Proteine oder Polypeptide anlagern können, blockiert werden. Dadurch wird die im Verfahren von 'Velasco' und 'Lee' notwendige Stufe, zwischen der Anlagerung des Caseins und der Reaktion mit den Antikörpern zunächst freie aktive Zentren der Microtiterplatte mit Milchproteinen zu blockieren, eingespart. Auch die in den Verfahren von "Velasco' und 'Lee' notwendige Blockierung der im reaktiven Protein enthaltenen freien Aminogruppen von Lysinresten des Proteins durch Methylierung oder Acetylierung wird überflüssig, da durch die Fixierung des Proteins auf der Oberfläche der Microtiterplatte aus Gründen der fehlenden Mobilität der Proteine zueinander diese freien Aminogruppen nicht mehr in Wechselwirkung mit freien Aminogrup- pen der Glutaminreste des Proteins treten können. So stehen alle freien Aminogruppen der Glutaminreste des Proteins für die Reaktion mit dem löslichen primären Amin der Reaktionsmischung zur Verfügung. Gleichzeitig vergrößert sich zudem die Auswahl der für das Verfahren einsetzbaren Proteine und Peptide.

Bei verschiedenen handelsüblichen Microtiterplatten aus Kunststoff, beispielsweise solchen aus Polystyrol, ist die Oberfläche so beschaffen, daß Proteine und Peptide in ausreichendem Maße nichtkovalent zu binden. Als Reaktionsgefäße können natürlich auch solche aus anderen Kunststoffen wie Polyethylen, Polycarbonat oder Polypropylen verwendet werden. Soweit diese die erforderlichen Proteine und Peptide nicht in ausreichendem Maße adsorbieren, kann die Oberfläche zusätzlich durch Glutaraldehyd, Cyanbromid oder andere Aktivatoren aktiviert werden.

Die Form der Reaktions- und Meßgefäße ist natürlich völlig variabel, so können bespielsweise Kunststoffreagenzröhrchen oder Zentrifugen-röhrchen oder Photometerküvetten verschiedenster Form verwendet werden. Am einfachsten und preiswertesten ist die Durchführung der Teste mit handelsüblichen Microtiterplatten, beispielsweise mit 96 Vertiefungen von jeweils 300 - 400 μl Volumen, oder Microtiterstrips mit 8, 12 oder 16 Vertiefungen von ebenfalls 300 - 400 μl Volumen, da diese sich für die Durchführung von Reihenversuchen besonders gut eignen.

Als Protein wird insbesondere Casein verwendet, da sowohl Faktor XIII wie auch Gewebe- und Zell-Transglutaminasen mit diesem Substrat reagieren. Jedoch können auch andere glutaminhaltige Substrate in gleicher Weise eingesetzt werden. Neben Caseinfraktionen oder proteolytischen Caseinderivaten kommen dafür natürliche Faktor XIII- oder Transglutaminasesubstrate wie Fibrinogen, Collagen, Fibronectin, Thrombospondin, etc. sowie Derivate und Fragmente dieser Proteine ebenso in Frage wie natürliche und synthetische Peptide, die das zur Reaktion notwendige Glutamin enthalten.

Voraussetzung ist, daß die Substanzen absolut frei von Transglutaminas sind, was bei nativem Fibrinogen und Fibronectin nicht imme gewährleistet ist. Da sich die glutaminhaltigen Substrate in ihrer Reak tionsfähigkeit mit den Transglutaminasen wie auch in ihrer Bindungs fähigkeit an die Kunststoffoberflächen der Reaktionsgefäße unterschei den, ist es erforderlich, bei der Messung der Transglutaminaseaktivitä Kontrollproben mit bekannter Aktivität mitzuführen.

Die Bindung des glutaminhaltigen Substrates an das Reaktionsgefäß (di Microtiterplatte) kann entweder kurz vor der eigentlichen Durchführun der Bestimmungen erfolgen, es können aber auch die beschichteten Platten unter sterilen Bedingungen gefertigt und gelagert werden.

Für das reaktive primäre Amin der Formel I sind solche besonders geeignet, welche eine lineare Methylenkette mit 4 - 8 C-Atomen besitzen, wobei soche mit 5 - 6 C-Atomen besonders bevorzugt sind. Bei kürzeren Ketten ist aus sterischen Gründen offensichtlich eine Reaktion nicht mehr möglich, bei längeren Ketten nimmt die Reaktionsgeschwindigkeit stark ab. Als Substituenten -X- der Formel (I) kommen praktisch alle Gruppen in Frage, welche die Transglutaminasereaktion nicht stören, jedoch eine Antikörperreaktion eingehen. Größere, gegebenenfalls substituierte carbozyklische Gruppen sind besonders geeignet, wobei eine gewisse Hydrophobizität die Reaktionsfähigkeit der nucleophiolen primären Aminogruppe zu erhöhen scheint.

Die aus der Literatur bekannten Substrate Dinitrophenylcadaverm, Biotinamido-pentylamin und Dansylcadaverin sind daher beispielsweise geeignet.

Neben monoclonalen Antikörpern können auch polyclonale Antikörper verwendet werden, sofern diese für die vorstehenden Substrate genügend spezifisch sind und in ausreichend reiner Form verfügbar sind, so daß eine Kopplung mit einem Indikatorenzym möglich ist. Eine Reinigung derartiger polyclonaler Antiseren kann durch Affinitätschromatographie oder Ionenaustauschchromatographie erfolgen. In jedem Fall muß durch eine Kontrollreaktion mit Faktor Xlll-freiem Plasma bzw. trans- glutaminasefreier Probe geprüft werden, daß bei solchen polyclonale Antikörpern keine Reaktivität mit den normalen Plasma- ode Probenkomponenten oder Komponenten der Beschichtungslösungen de Reaktionsgefaße besteht.

Als Markierung für die verwendeten Antikörper kommt vorzugsweise ei Enzym in Frage, um dadurch die Analysenempfindlichkeit entsprechen zu steigern. Die in der Technik gebräuchlichen Markierungen mit alka lischer Phosphatase, Peroxidase oder Urease können auch für diese Test mit Vorteil eingesetzt werden. Entsprechende Nachweisreagenzien sin bekannt, beispielsweise seien für die alkalische Phosphatase p-Nitro phenylphosphat, für Peroxidase 2,2'-Azino-bis-(3-ethylbenzthiazolin-6-sul fonsäure) oder o-Phenylendiamin und für Urease Bromcresolpurpur ge nannt.

Soweit es für die Nachweisempfindlichkeit ausreicht, können auc Markierungen mit chromophoren, insbesondere fluoreszierenden Grup pen verwendet werden, wodurch die zusätzlichen Nachweisreaktione verbleiben und die Reaktion direkt photometrisch verfolgt werden kann Radioaktive Markierungen sind wegen der damit verbundenen Sicher heitsvorkehrungen und des apparativen Aufwandes in vielen Laborato rien nicht" erwünscht, jedoch läßt sich selbstverständlich das erfindungs gemäße Verfahren auch durch eine radioaktive Markierung entwede des eingesetzten primären Amins, oder des verwendeten Antikörper durchführen. Im ersteren Falle kann bereits die Stufe der Antikörper markierung des Reaktionsproduktes entfallen, in dem zweiten Fall kan erst anschließend an diese Markierung und die Auswaschung über schüssiger Antikörper eine Radioaktivitätsmessung der gebundenen Sub strate erfolgen.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere auf den Nachweis de Blutgerinnungsfaktors XIII (Plasmatransglutaminase) ausgearbeite worden, jedoch können auch die anderen Enzyme der Nummer EC 2.3.2.13 auf diese Weise bestimmt werden.

In den folgenden Beispielen ist die Erfindung näher beschrieben, ohne daß dadurch eine Beschränkung beabsichtigt ist.

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Beispiel 1

Belegen einer Microtiterplatte mit Casein

a) Nichtkovalente Bindung durch hydrophobe Interaktion

Gereinigte Microtiterplatten mit 96 Vertiefungen ä 400 μl aus Polystyrol werden mit einer Lösung aus Casein in 0.1 M Phosphatpuffer pH 8.0, oder 0.05 M Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan und 0.1 M NaCl, pH 8.5 bei 37°C inkubiert. Die optimale Konzentration des Caseins liegt zwischen 3 und 6 μg/ml Lösung, die Inkubationszeit bei 37°C sollte mindenstens 2 Stunden und höchstens 24 Stunden betragen. Die Microtiterplatten werden anschließend entleert und mit einer Pufferlösung, beispielsweise mit gepufferter NaCl-Lösung gespült.

b) Kovalente Bindung nach Aktivierung mit Glutaraldehyd

Gereinigte Microtiterplatten mit 96 Vertiefungen ä 400 μl aus Polystyrol werden mit einer Lösung aus 0.25 % Glutaraldehyd in 0.1 M Phosphatpuffer pH 5.0 für 4 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Lösung wird ausgekippt, die Platten mit 0.1 M Phosphatpuffer pH 5.0 gewaschen, mit der Caseinlösung aus 3 - 6 μg/ml Casein in 0.1 M
Phosphatpuffer pH 8.0 gefüllt und zwischen 2 und 24 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Lösung wird anschließend ausgekippt und die Platten 1 Stunde mit einer Lösung aus 0.1 M Glycin oder Ethanolamin in 0.1 M Phosphatpuffer pH 8.0 bei 37°C inkubiert, um freie aktive Gruppen zu blockieren. Die Microtiterplatten werden anschließend entleert und mit einer Pufferlösung, beispielsweise mit gepufferter NaCl-Lösung gespült.

Die Auswirkung der Caseinkonzentration in der Caseinlösung auf die Empfindlichkeit des Tests für zwei Typen von Polystyrol-Microtiterplatten mit und ohne Glutaraldehydaktivierung ist in Abbildungen 1 und 2 gezeigt. Eine optimale Empfindlichkeit wird in einem Konzentrationsbereich von 1 - 10, vorzugsweise von 3 - 6 μg Casein pro ml Pufferlösung erzielt.

Abbildung 3 zeigt vergleichende Versuche mit Casein und dem proteo lytischen Fibrinogenfragment D als Beschichtungsmaterial. Sowohl Ca sein wie Fibrinogenfragment D zeigen eine der Transglutaminase- aktivität des Faktors XIII proportionale empfindliche Reaktion. Die Messungen für die Abbildungen 1, 2 und 3 wurden gemäß Beispiel 2 und 3 mit standardisierten Proben bekannter Faktor XHI-Aktivität durchgeführt.

Beispiel 2

Durchführung der Transglutaminasereaktion zur Messung der Faktor XIII-Aktivität

a) Pufferlösung zur Probenverdünnung

Eine Pufferlösung wird hergestellt aus :
0.05 M Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan und
0.05 M Natriumchlorid
und der pH mit 1 M HC1 auf einen Wert von 7.4 eingestellt.

Die eingesetzten Proben werden mit dem Probenverdünnungspuffer verdünnt, wobei zur Messung der Faktor XIII-Aktivität im menschlichen Blutplasma eine Verdünnung zwischen 1 : 15 und 1 : 40, insbesondere 1 : 20 verwendet wird. Für andere Proben ergeben sich andere Verdünnungsfaktoren.

b) Pufferlösung zum Waschen der Microtiterplatten

Eine Puffer-Stammlösung wird hergestellt aus :
0.2 M Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, pH 7.4
1.4 M Natriumchlorid
0.003 M Kaliumchlorid
0.5 % Tween 20 (Polyethoxysorbitanlaureat)
und vor Gebrauch 1 : 10 mit destilliertem Wasser verdünnt.

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c) Substratlösimg

Die Substratlösung des aktiven Amins wird hergestellt aus:
0.1 M Tris-(hydroxymethyl)-aminomethanpuffer, pH 7.4
0.1 M Natriumchlorid
0.06 M Calciumchiorid
0.005 M Dithioerythritol (DTE)
0.001 M Dinitrophenylcadaverin (DNPC)

d) Thrombinlösung

1000 - 1500 NIH U lyophilisiertes Thrombin werden in 10 ml destilliertem Wasser gelöst.

Durchfuhrunςr der Reaktion

Eine Microtiterplatte (96 Vertiefungen) gemäß Beispiel 1 wird mit Lösung b) gespült. Je Vertiefung werden 100 μl verdünnte Probe, 100 μl Substratlösung c) und 100 μl Thrombinlösimg eingefüllt (2 bis 3 Parallelversuche pro Probe und Kontrolle mit Standardplasma mit bekannter Trans- glutaminasekonzentration und Faktor Xπi-Mangelplasma). Nach 10 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur wird der Reagenzüberstand mit Lösung b) ausgespült.

Beispiel 3

Verstärkung der Meßempfindlichkeit durch das Antikörper-Enzvmkon-iugat

Microtiterplatten gemäß vorstehendem Beispiel werden anschließend an die Substratreaktion mit 250 μl/Vertiefung einer Anti-Dinitrophenyl-Antikörperkonjugat-Lösung aus 25 μl Antikörperkonjugat (Phosphatase- markiert) und 25 ml Lösung b) versetzt und 60 Minuten be Raumtemperatur inkubiert.

Das Antikörper-Enzymkonjugat wird durch Glutaraldehyd-Kopplung au kommerziell erhältlichem Antikörper (Fa. Sigma, Deisenhofen) un kommerziell erhältlichem Enzym alkalische Phosphatase (Fa Boehringer, Mannheim) nach einer von Harlow und Lane beschriebene Methode hergestellt (Harlow E, Lane D, Antibodies: A laboratory manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, U.S.A. (1988) Andere Methoden zur Kopplung von Antikörpern und Enzymen könne im beschriebenen Verfahren ebenso eingesetzt werden.

Nach der Inkubation wird die Microtiterplatte mit Lösung b) gewasche und mit 250 μl Phosphatase-Substratlösung pro Vertiefung versetzt.

Zur Herstellung der Phsphatase-Substratlösung werden gemischt:
5 ml 1 M Diethanolamin, 0.01 M Magnesiumchlorid, pH 9.5
15 mg p-Nitrophenylphosphat (Substrattablette, z.B. Fa. Sigma, Deisenhofen)
20 ml destilliertes Wasser.

Anschließend wird die Absorption bei 405 nm photometrisch gemessen. Die Messung kann kinetisch durch Messungen nach festgelegten Inkubationszeiten, vorzugsweise nach 10, 20, 30, 40, 50 und 60 Minuten, oder durch Endpunktmessung nach Hinzufügen eines Stopreagenzes, vorzugsweise 50 μl pro Vertiefung einer 3 M NaOH-Lösung, durchgeführt werden.

Durch Vergleich mit der Absorption der Kontrollen wird die Faktor XIII-Aktivität errechnet. Eine entsprechende Eichkurve ist in Abbildung 4 gezeigt.