Anmerkung: Text basiert auf automatischer optischer Zeichenerkennung (OCR). Verwenden Sie bitte aus rechtlichen Gründen die PDF-Version.
[ ZH ]
| 本发明涉及通过组合生物技术和化学步骤制备甲硫氨酸。 |
| 特别地，本发明涉及通过在一个或多个步骤中使L-高丝氨酸发酵和随 后化学转化成L-甲硫氨酸而进行制备。 |
| 目前在全世界范围内，氨基酸甲硫氨酸在工业上被大量制备，并且在 商业上相当重要。 |
| 甲硫氨酸可用于多种领域，例如，药物、卫生和健康产品。特别地， 然而，甲硫氨酸被用作各种畜牧动物用的很多饲料中的饲料添加剂，外消 旋形式和对映体纯形式的甲硫氨酸均可被使用。 |
| 在工业规模上，经Bucherer-Bergs反应化学制备甲硫氨酸，该反应是 Strecker合成的一种变型。在该方法中，原料物质甲基巯基丙醛(从丙烯醛和 甲基硫醇制备)、氢氰酸、氨和二氧化碳反应形成5-(2-甲基巯基乙基)乙内 酰脲(甲硫氨酸乙内酰脲)，随后在碱性条件下水解，得到碱金属甲硫氨酸盐， 然后用酸例如硫酸或碳酸中和放出甲硫氨酸。多种其他方法也可用于制备 甲硫氨酸，例如酰氨基羰基化反应、蛋白的水解或发酵。 |
| 由于在工业上甲硫氨酸被大规模地制备，因而需要具有经济且环境友 好的方法。 |
| Strecker合成和Bucherer-Bergs反应它们的缺点均在于，毒性前体氢氰 酸和丙烯醛分别被用作C
1
-和C
3
-结构单元。在高温下从甲烷和氨水制备氢 氰酸。通过部分氧化丙烯制备丙烯醛，而从石油制备丙烯。例如，在EP 1256571中更详细地描述了制备甲硫氨酸的方法。例如，在EP 417723中更 详细地描述了制备丙烯醛的方法。这两种方法均涉及到设备的大量使用和 高能量需求。 |
| 由于近年来石油价格上涨，丙烯醛也正日益变得更昂贵，因此越来越 少用作结构单元，并且经济吸引力变小。此外，由于在安全和环保方面的 毒性和物理性能的原因，不仅氢氰酸而且丙烯醛在大量处理时均造成相应 的支出。 |
| 在化学合成中甲硫氨酸被制备成D和L对映体的外消旋混合物。这种 外消旋物可以直接用作饲料添加剂，因为在体内条件下，存在将非天然的D 对映体转化成天然的L对映体的转化机制。然而，这种转化与甲硫氨酸的 损失有关，因此与相同量的纯L对映体相比生物效率下降。因此，为获得 相同效果，与L-甲硫氨酸相比，需要更多的外消旋D，L-甲硫氨酸。 |
| 因此，需要提供一种制备甲硫氨酸的尽可能有较大的经济效益并且更 为环境友好和更安全的方法。特别地，需要提供一种制备对映体富集的L- 甲硫氨酸的方法，极特别优选尽可能对映体纯的L-甲硫氨酸，并且能够以 工业规模进行。 |
| 例如在WO04/024933中记载的使用微生物制备L-甲硫氨酸的在先方法 其缺点在于，获得的产率相当低。其原因特别是在于微生物L-甲硫氨酸生 物合成的严格组织的调控网络的问题，其中从细胞将甲硫氨酸分泌到发酵 液中，并且在将硫酸酯还原成硫化氢时耗能的8电子步骤。其次，甲硫氨 酸在水中或在水性发酵液中有限的溶解度具有如下影响，在发酵中甲硫氨 酸在高度生物合成性能时会沉淀，从而使纯化变难。复杂的纯化导致产生 相当多的废物流，除去它们将花费高成本。 |
| 尽管在WO05/059155中记载了改善从发酵液中分离L-甲硫氨酸的方 法，然而，通过相当复杂的一系列步骤获得改善，这一系列步骤包括在发 酵液中加热和溶解L-甲硫氨酸、在预定温度下过滤生物质和后处理过滤出 的含有甲硫氨酸的生物质、经蒸发浓缩母液、冷却、结晶、从母液过滤出 L-甲硫氨酸、洗涤和干燥以及使母液再循环，并且生成两种不同的产物流， 即低浓度和高浓度L-甲硫氨酸产物。然而，强制性生成两种不同的甲硫氨 酸质量等级意味着再次增大的成本，并且从市场的观点来看，这不希望的。 |
| 所述问题最终导致与例如L-赖氨酸的发酵制备方法(已经用于工业中很 多年)相比纯粹的发酵L-甲硫氨酸方法总产率更低和/或导致经发酵制备L- 甲硫氨酸中相应的额外支出。 |
| 针对现在技术中的缺点，特别地，目的是提供一种可以克服现有技术 方法中上述详细缺点的甲硫氨酸用方法。该方法应尽可能地从另一种可用 并可经发酵产生的前体出发，以最简单可行方式且未使用上述有害化学品， 得到L-、D-或D，L-甲硫氨酸，但优选得到L-甲硫氨酸，并且按此方式特别 是克服常规甲硫氨酸用化学方法和直接生物技术制备方法的缺点。 |
| 另一目的是提供一种可以至少部分地从天然或可再生原料进行的制备 方法。 |
| 第三目的是提供一种在技术上可以没有问题地进行的方法，使得可以 适宜量和纯度得到L-甲硫氨酸。 |
| 这些目的以及没有明确提及但可以从文中所述没有问题地得出或推导 出的其他目的，如下实现：以可用并可经发酵更好地产生的另一种氨基酸 用作原料，然后未使用上述有害化学品经适合的化学转换成L-、D-或D，L- 甲硫氨酸，但特别是转换成L-甲硫氨酸。按此方式，不仅克服了甲硫氨酸 用常规化学制备方法的缺点，而且克服了L-甲硫氨酸用经直接发酵的常规 制备方法的缺点。已证实，根据本发明，氨基酸高丝氨酸是适合的，与甲 硫氨酸相比，其具有高的水溶解度并且可经发酵方法得到。 |
| Livak，Britton，VanderWeele和Murray(“Synthesis of dl-methionine”， Journal of the American Chemical Society，(1945)，67，2218-20)记载了途径， 其中D，L-高丝氨酸作为合成中间体，首先从D，L-2-氨基-4-丁内酯出发，经 D，L-高丝氨酸、N-氨基甲酰基高丝氨酸、4-(2-溴甲基)乙内酰脲和4-(2-甲硫 基乙基)乙内酰脲，最终生成D，L-甲硫氨酸： |
| 根据Son和Woodard(“Stereochemical mechanism of iodoacetic acid mediated decomposition of L-methionine to L-homoserine lactone”，Journal of the American Chemical Society(1989)，111(4)，1363-7)，氘代高丝氨酸衍生 物HO-CHD-CH
2
-CH(HNCOOtBu)COOtBu或 H
3
CC
6
H
4
SO
2
O-CHD-CH
2
-CH(HNCOOtBu)COOtBu(tBu＝叔丁基)用作在4 位相应氘代的L-高丝氨酸的前体。相应的非氘代化合物 HO-CH
2
-CH
2
-CH(HNCOOtBu)COOtBu或 H
3
CC
6
H
4
SO
2
O-CH
2
-CH
2
-CH(HNCOOtBu)COOtBu没有被记载为关于高丝氨 酸的途径。 |
| 随后目标化合物3，6-二(2-羟基乙基)-2，5-二酮哌嗪、3，6-二(2-氯乙 基)-2，5-二酮哌嗪或3，6-二(2-甲硫基乙基)-2，5-二酮哌嗪是化学中间体，根据 US2,397,628，通过它们成为到D，L-甲硫氨酸的途径，然而，不是从高丝氨 酸开始，而是从2-乙酰基-4-丁内酯开始： |
| 此外，根据Snyder，Andreen，John，Cannon和Peters(“Convenient synthesis of dl-methionine”，Journal of the American Chemical Society(1942)， 64，2082-4)，其他D，L-甲硫氨酸用制备方法，同样不从高丝氨酸开始，而 是例如从2-乙酰基-4-丁内酯开始经2-氨基-4-丁内酯或适宜保护的2-氨基-4- 丁内酯。 |
| 根据Plieninger，合成从2-氨基-4-丁内酯开始(“Die Aufspaltung des γ-Butyrolactons und α-Amino-γ-butyrolactons mit Natriummethylmercaptid bzw.-selenid.Eine Synthese des Methionins”[The Cleavage of γ-Butyrolactone andα-Amno-γ-butyrolactone using Sodium Methyl Mercaptide or Selenide.A Synthesis of Methionine]，Chemische Berichte(1950)，83，265-8)。 |
| 随后目标化合物，3，6-二(2-乙烯基)-2，5-二酮哌嗪和3，6-二(2-溴乙 基)-2，5-二酮哌嗪，同样是化学前体。 |
| 根据Snyder和Chiddix(“Non-Markovnikov addition in reactions of 3，6-divinyl-2，5-diketopiperazine”，Journal of the American Chemical Society (1944)，66，1002-4)，通过它们成为D，L-甲硫氨酸的途径。然而，这里也 未使用高丝氨酸。 |
| 特别地，根据权利要求1所述的方法实现上述目的。本发明方法的有 利形式和变化受从属于权利要求1的从属权利要求的保护。 |
| 按此方式，一种从高丝氨酸开始制备L-甲硫氨酸、D-甲硫氨酸或任何 L-和D-甲硫氨酸的所需的混合物的方法，其中下式I的L-高丝氨酸、D-高 丝氨酸或L-和D-高丝氨酸的相应的混合物经化学转换转化成甲硫氨酸， |
| 而没有经过任何中间体N-氨基甲酰基高丝氨酸、4-(2-溴乙基)乙内酰脲 和4-(2-甲硫基乙基)乙内酰脲(式A-C)， |
| 成功地克服了所述纯粹化学或直接生物技术方法的缺点。 |
| 特别地，当经发酵制备所用的L-高丝氨酸时，克服了这些缺点。还已 知的是，经微生物发酵可以制备L-高丝氨酸，特别是肠杆菌科的细菌或棒 状杆菌，其中使用碳源，例如，蔗糖、葡萄糖、果糖和甘油或其混合物， 以及常用氮源，例如，氨。 |
| 使用肠杆菌科特别是大肠杆菌对L-高丝氨酸进行微生物制备的例子可 以在US 6,303,348、US 6,887,691或US 6,960,455或EP 1217076 A1中找到。 |
| 使用棒状杆菌特别是谷氨酸棒杆菌对L-高丝氨酸进行微生物制备的例 子可以在US 3,189,526或US 3,598,701中找到。 |
| 使用经发酵得到的L-高丝氨酸，成功地避免了所述相对有害的原料丙 烯醛和氢氰酸。 |
| 然而，还有利的是，混合经发酵得到的L-高丝氨酸与经化学途径用经 典法制备的外消旋D，L-高丝氨酸，并使用得到的D-和L-高丝氨酸混合物进 行化学转换，最后从它们生成相应的D-和L-甲硫氨酸混合物。这可能是有 利的，特别是当D-/L-高丝氨酸将被用作D-/L-高丝氨酸制备的化学制备方 法的残余物时。还可以使用纯的D-高丝氨酸。这可能是有利的，特别是当 D-高丝氨酸被用作从D-/L-高丝氨酸外消旋物分离的残余物时。然而，使用 纯的D-高丝氨酸通常仅在具体制备D-甲硫氨酸时是有利的。 |
| 使用经发酵制备的L-高丝氨酸，相比而言，直接得到L-甲硫氨酸，并 且事实上，使用根据本发明的化学方法步骤，不会损害L构型。在仅使用 L-高丝氨酸的情况下，最终制得纯的L-甲硫氨酸，其可被直接用于药物和 食物用途，并且与常规D，L-甲硫氨酸相比，因较高的生物效率而在动物营 养中突出。本发明方法的这一方面通常具有最大利益。 |
| 在优选的方法中，使用通过从含有L-高丝氨酸的发酵液除去水制备的 含有L-高丝氨酸的固体产物。其优点在于，首先可以在最后纯化步骤中分 离L-甲硫氨酸阶段中的发酵副产物，这样可以节省纯化支出。如果适宜， 发酵的副产物和/或伴随物质也可以保留在终产物中，如果它们不会干扰后 续反应或者在终产物中是需要的。特别地，如果它们本身具有营养性能并 且L-甲硫氨酸用于饲料生产，就是这种情况。营养活性化合物例如可以是 另外的氨基酸或蛋白。 |
| 因此，本发明也涉及一种经发酵L-高丝氨酸制备的L-甲硫氨酸和副产 物和/或伴随物质的混合产物。 |
| 通过在适合的营养介质中培养分泌L-高丝氨酸的微生物，可方便地制 备含有L-高丝氨酸的发酵液。 |
| 作为微生物，优选使用细菌，特别是棒状杆菌属或埃希氏菌属的细菌。 |
| 此外，已证实当发酵液中L-高丝氨酸的浓度至少为1g/l时是有利的。 |
| 令人惊讶的是，已经发现，如果适宜的话在酸催化剂存在下，使用甲 基硫醇(MeSH)可以直接进行L-和/或D-高丝氨酸的化学转换。这样具有极 大的优点，即单一化学步骤直接形成终产物L-甲硫氨酸。甲基硫醇可以大 大过量使用，未消耗的甲基硫醇随后可以容易地分离和再循环，因为与氨 基酸相比，它在室温下是气态化合物。 |
| 这里，已证实有利的是使用1-100mol当量、优选1-50mol当量的 MeSH。 |
为加速反应和为提高产率，还已证实当使用选自pK
a
≤3的 酸的酸催化剂时是有利的。 |
| 这种酸例如是HCl、HBr、HI、H
2
SO
4
、(碱金属)HSO
4
、H
3
PO
4
、(碱金 属)H
2
PO
4
、多磷酸、C
1
-C
12
-烷基磺酸、C
6
-C
10
-芳基磺酸、三氟甲磺酸、三氟 乙酸、或四氟乙烯和全氟-3，6-二氧代-4-甲基-7-辛烯磺酸(Nafion)的共聚物， 其中碱金属是锂、钠、钾、铷或铯。作为固体催化剂的Nafion其优点特别 在于在反应后可以容易地从反应混合物分离并再循环。 |
| 同样，当使用Lewis酸催化剂时是有利的。这里可以提及的有特别是 具有选自AlCl
3
、ZnCl
2
、BF
3
·OEt
2
、SnCl
2
、FeCl
3
的至少一种低分子量Lewis 酸的Lewis酸催化剂。 |
| 此外，同样可以特别容易地回收的强酸性离子交换树脂已证实是有利 的，特别是交联的聚苯乙烯磺酸树脂，任选被取代，例如被二乙烯基苯取 代。 |
| 然而，根据本发明还可以使用选自沸石、蒙脱石和含有(WO
3
-和Cs
2
O) 的氧化铝的多相酸催化剂。在所述氧化铝中，优选具有5-15％WO
3
和5-15％ Cs
2
O含量的那些。 |
| 便利的是，反应在水和/或有机溶剂的存在下在溶液和/或悬浮体中进 行。如果反应在水的存在下进行，那么可以方便地直接从含有L-高丝氨酸 的发酵水溶液出发，任选地没有固体部分，因为按此方式有利的是可以活 力进一步的处理步骤。然而，相应有利的是还可以使用水性粗L-高丝氨酸。 |
| 例如，根据本发明，可以使用水和/或至少一种低分子量有机溶剂，所 述有机溶剂选自C
3
-C
6
酮，优选MIBK或丙酮；直链或枝化的C
1
-C
4
醇；C
4
-C
10
羧酸酯，优选乙酸乙酯或乙酸丁酯；C
3
-C
6
羧酰胺，优选DMF或二甲基乙 酰胺；C
6
-C
10
芳香族化合物，优选甲苯；和C
3
-C
7
环状碳酸酯，优选碳酸亚 乙酯、碳酸亚丙酯或碳酸亚丁酯。然而，相应过量使用的甲基硫醇也可以 用作溶剂或至少作为共溶剂。 |
| 根据本发明另一个优选的实施方案，将L-和/或D-高丝氨酸化学转换成 甲硫氨酸的方法也可以按以下方式进行，在第一步中，通过在高丝氨酸的 C
4
原子上引入离去基团Y，制备式II的化合物， |
| 其中Y是卤素(＝氯、溴或碘)、磺酰氧基(＝p-甲苯磺酰氧基[pTsO]、 C
6
H
5
SO
3
、H
3
CSO
3
、H
5
C
2
SO
3
或CF
3
SO
2
)、硫酸酯基(OSO
3
H)或磷酸酯基 (OPO
3
H)，然后化合物II在第二步中与MeSH反应得到L-甲硫氨酸、D-甲 硫氨酸或L-和D-甲硫氨酸的相应的混合物。 |
| 当Y＝卤素时，在第一步中通过高丝氨酸与PCl
5
、PCl
3
、BBr
3
、PI
3
、 POCl
3
、SOCl
2
或SOBr
2
的反应相应地有利地进行离去基团Y的引入。 |
| 当Y＝磺酰氧基时，在第一步中通过与p-甲苯磺酰氯(p-TsCl)、 C
6
H
5
SO
2
Cl、H
3
CSO
2
Cl、H
5
C
2
SO
2
Cl或CF
3
SO
2
Cl的反应相应地有利地进行 离去基团Y的引入。 |
| 相比而言，当Y＝硫酸酯基时，为引入离去基团Y，在第一步中通常 相应地使用SO
3
、H
2
SO
4
或发烟硫酸，当Y＝磷酸酯基时，优选使用多磷酸 引入Y。 |
| 通过在4位引入相应的离去基团Y活化高丝氨酸之后，在下一步骤中， 可以通过取代Y特别容易地引入Me-S基团。 |
| 通过在碱性催化剂或酸催化剂的存在下使式II的化合物与MeSH反应 有利地进行这种取代。 |
| 适合的碱性催化剂特别是NaOH、KOH、吡啶、三甲胺、三乙胺或碱 金属或碱土金属的乙酸盐、碳酸盐或碳酸氢盐，其中碱金属是锂、钠、钾、 铷或铯，碱土金属是镁、钙或钡。 |
| 适合的酸催化剂特别是使用HCl、HBr、HI、H
2
SO
4
、(碱金属)HSO
4
、 H
3
PO
4
、(碱金属)H
2
PO
4
、多磷酸、C
1
-C
12
-烷基磺酸、C
6
-C
10
-芳基磺酸、三氟 甲磺酸、三氟乙酸、或四氟乙烯和全氟-3，6-二氧代-4-甲基-7-辛烯磺酸(Nafion) 的共聚物，其中碱金属是锂、钠、钾、铷或铯，。 |
| 作为有机溶剂，优选使用低分子量有机溶剂，所述有机溶剂选自C
3
-C
6
酮类，优选甲基异丁基酮(MIBK)或丙酮；直链或枝化的C
1
-C
4
醇类；C
4
-C
10
羧酸酯类，优选乙酸乙酯或乙酸丁酯；C
3
-C
6
羧酰胺类，优选DMF或二甲 基乙酰胺；C
6
-C
10
芳香族化合物，优选甲苯，和C
3
-C
7
环状碳酸酯类，优选 碳酸亚乙酯、碳酸亚丙酯或碳酸亚丁酯。 |
| 根据本发明更优选的实施方案，将L-和/或D-高丝氨酸化学转换成甲硫 氨酸的方法也可以按以下方式进行，在第一步中，通过酸催化的环化，制 备相应的式III的2-氨基-4-丁内酯或其盐(式IV)， |
| 其中X是Cl、Br、I、HSO
4
、(SO
4
)
1/2
、H
2
PO
4
、(HPO
4
)
1/2
、(PO
4
)
1/3
或R′-SO
3
(其中R′＝甲基、乙基、苯基、甲苯磺酰基)，然后在第二步中将第一步中 所得的式III的2-氨基-4-丁内酯或其盐与MeSH反应得到L-甲硫氨酸、D- 甲硫氨酸或L-和D-甲硫氨酸的相应的混合物。特别地，盐是稳定的中间体， 可以被临时保存或输送，这是一个可取的优点。 |
适合的酸催化剂是选自pK
a
≤3的 酸的酸。 |
| 优选地，作为酸催化剂，使用HCl、HBr、HI、H
2
SO
4
、(碱金属)HSO
4
、 H
3
PO
4
、(碱金属)H
2
PO
4
、多磷酸、C
1
-C
12
-烷基磺酸、C
6
-C
10
-芳基磺酸、三氟 甲磺酸、三氟乙酸、或四氟乙烯和全氟-3，6-二氧代-4-甲基-7-辛烯磺酸(Nafion) 的共聚物，其中碱金属是锂、钠、钾、铷或铯，。 |
| 同样，强酸性离子交换树脂适合作为酸催化剂，在这种情况下特别是 交联的聚苯乙烯磺酸树脂，所述树脂任选被取代，优选被二乙烯基苯取代。 |
| 根据本发明，还可以使用选自含有(WO
3
-和Cs
2
O)的氧化铝、沸石和蒙 脱石的多相酸催化剂。在所述氧化铝中，优选具有5-15％WO
3
含量和5-15％ Cs
2
O含量的那些。 |
| 同样，可以使用Lewis酸催化剂，特别是选自AlCl
3
、ZnCl
2
、BF
3
·OEt
2
、 SnCl
2
、FeCl
3
的低分子量Lewis酸，它们是可得到的并且便宜。 |
| 根据本发明更优选的实施方案，将高丝氨酸化学转换成甲硫氨酸的方 法还可以被设计成通过以下方式进行： |
| a)使用酰化剂使L-和/或D-高丝氨酸N-酰化，得到式V的N-酰基-L- 和/或D-高丝氨酸， |
| 其中R＝氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁 基、苯基、单、二或三卤代烷基，其中卤素＝F或Cl，优选CF
3
或CCl
3
， 苄氧基羰基或C
1
-C
4
-烷氧基羰基，优选叔丁氧基羰基或甲氧基羰基， |
| b)在碱性催化剂或酸催化剂的存在下使步骤a)中得到的N-酰基高丝氨 酸V与MeSH反应，得到式VI的N-酰基甲硫氨酸， |
| c)水解步骤b)中得到的N-酰基-L-和/或D-甲硫氨酸，得到相应的甲硫 氨酸。 |
| 根据反应条件的精确选择，在步骤a)中，首先形成相应的O-酰基高丝 氨酸，随后重排形成N-酰基高丝氨酸V，或在一个步骤中直接形成V。 |
| 对于步骤a)中的酰化，优选使用通式R-CO-X1的酰化剂，其中X1可以 是R1COO、OR2(R2＝甲基或乙基)、Cl、Br，R和R1可以相同或不同并且 是氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、苯基、 单、二或三卤代烷基，其中卤素＝F或Cl，优选CF
3
或CCl
3
，苄氧基羰基 或C
1
-C
4
-烷氧基羰基，优选叔丁氧基羰基或甲氧基羰基。 |
| 作为步骤b)中的碱性催化剂，可以使用NaOH、KOH、吡啶、三甲胺、 三乙胺或碱金属或碱土金属的乙酸盐、碳酸盐或碳酸氢盐，其中碱金属是 锂、钠、钾、铷或铯，碱土金属是镁、钙或钡。 |
| 步骤b)用的适合的酸催化剂特别是HCl、HBr、HI、H
2
SO
4
、(碱金 属)HSO
4
、H
3
PO
4
、(碱金属)H
2
PO
4
、多磷酸、C
1
-C
12
-烷基磺酸、C
6
-C
10
-芳基 磺酸、三氟甲磺酸、三氟乙酸、或四氟乙烯和全氟-3，6-二氧代-4-甲基-7-辛 烯磺酸(Nafion)的共聚物，其中碱金属是锂、钠、钾、铷或铯。 |
| 根据本发明更优选的实施方案，将高丝氨酸化学转换成甲硫氨酸的方 法还可以被设计成通过以下步骤进行： |
| a)使用酰化剂使L-和/或D-高丝氨酸N-酰化，得到式V的N-酰基-L- 和/或D-高丝氨酸， |
| 其中R是氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁 基、苯基、单、二或三卤代烷基，其中卤素＝F或Cl，优选CF
3
或CCl
3
， 苄氧基羰基或C
1
-C
4
-烷氧基羰基，优选叔丁氧基羰基或甲氧基羰基， |
| b)通过在C4原子上引入离去基团Y，，使步骤a)中得到的化合物V转 化为式VI的化合物， |
| 其中Y是卤素(＝氯、溴或碘)、磺酰氧基(＝pTsO、C
6
H
5
SO
3
、H
3
CSO
3
或H
5
C
2
SO
3
)、硫酸酯基(OSO
3
H)或磷酸酯基(OPO
3
H)， |
| c)在碱性催化剂或酸催化剂的存在下，使步骤b)中得到的化合物VI与 MeSH反应，得到式VII的N-酰基-L-甲硫氨酸、N-酰基-D-甲硫氨酸或N- 酰基-L-和/或D-甲硫氨酸的相应的混合物， |
| d)水解步骤c)中得到的N-酰基-L-和/或D-甲硫氨酸VII，得到L-和/或 D-甲硫氨酸。 |
| 根据反应条件的精确选择，通过重排首先形成的O-酰基高丝氨酸得到 N-酰基高丝氨酸，或通过原位内酯化和酰化与随后开环的组合，形成化合 物V。 |
| 对于步骤a)中的酰化，优选使用通式R-CO-X1的酰化剂，其中X1＝ R1COO、OR2(R2＝甲基或乙基)、Cl或Br，R和R1可以相同或不同并且是 氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、苯基、单、 二或三卤代烷基，其中卤素＝F或Cl，优选CF
3
或CCl
3
，苄氧基羰基或C
1
-C
4
- 烷氧基羰基，优选叔丁氧基羰基或甲氧基羰基。 |
| 当Y＝卤素时，在第一步中通过高丝氨酸与PCl
3
、BBr
3
、PI
3
、SOCl
2
或SOBr
2
的反应相应地有利地进行离去基团Y的引入。 |
| 当Y＝磺酰氧基时，在第一步中通过与对甲苯磺酰氯(p-TsCl)、 C
6
H
5
SO
2
Cl、H
3
CSO
2
Cl、H
5
C
2
SO
2
Cl或CF
3
SO
2
Cl的反应相应地有利地进行 离去基团Y的引入。相比而言，当Y＝硫酸酯基时，为引入离去基团Y， 在第一步中通常相应地使用SO
3
、H
2
SO
4
或发烟硫酸。当Y＝磷酸酯基 (OPO
3
H)时，为引入离去基团Y，在第一步中通常使用多磷酸。 |
| 通过在4位引入相应的离去基团Y活化N-酰基高丝氨酸之后，在下一 步骤中，可以通过取代Y特别容易地引入Me-S基团。 |
| 步骤c)中的适合的碱性催化剂特别是NaOH、KOH、吡啶、三甲胺、 三乙胺、或者碱金属或碱土金属的乙酸盐、碳酸盐或碳酸氢盐，其中碱金 属是锂、钠、钾、铷或铯，碱土金属是镁、钙或钡。 |
| 步骤c)中的适合的酸催化剂特别是HCl、HBr、HI、H
2
SO
4
、(碱金 属)HSO
4
、H
3
PO
4
、(碱金属)H
2
PO
4
、多磷酸、C
1
-C
12
-烷基磺酸、C
6
-C
10
-芳基 磺酸、三氟甲磺酸、三氟乙酸、或四氟乙烯和全氟-3，6-二氧代-4-甲基-7-辛 烯磺酸(Nafion)的共聚物，其中碱金属是锂、钠、钾、铷或铯。 |
| 根据本发明更优选的实施方案，将L-和/或D-高丝氨酸化学转换成甲硫 氨酸的方法还可以被设计成通过以下步骤进行： |
| a)使用酰化剂使L-和/或D-高丝氨酸N-酰化和环化，得到式VIII的N- 酰基-L-和/或D-高丝氨酸内酯， |
| 其中R是氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁 基、苯基、单、二或三卤代烷基，其中卤素＝F或Cl，优选CF
3
或CCl
3
， 苄氧基羰基或C
1
-C
4
-烷氧基羰基，优选叔丁氧基羰基或甲氧基羰基， |
| b)在碱性催化剂或酸催化剂的存在下使步骤a)中得到的N-酰基高丝氨 酸内酯与MeSH反应，得到相应的式VII的N-酰基甲硫氨酸， |
| c)在＞95℃的温度下水解步骤b)中得到的N-酰基-L-和/或D-甲硫氨酸， 得到相应的甲硫氨酸。 |
| 对于步骤a)中的酰化，优选使用通式R-CO-X1的酰化剂，其中X1＝ R1COO、OR2(R2＝甲基或乙基)、Cl或Br，R和R1可以相同或不同并且是 氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、苯基、单、 二或三卤代烷基，其中卤素＝F或Cl，优选CF
3
或CCl
3
，苄氧基羰基或C
1
-C
4
- 烷氧基羰基，优选叔丁氧基羰基或甲氧基羰基。通过重排首先形成的O-酰 基高丝氨酸得到N-酰基高丝氨酸与随后闭环，或通过原位内酯化和直接N- 酰化的组合，进行步骤a)中的N-乙酰化。 |
| 此外，在步骤a)的酰化中，作为溶剂，优选使用羧酸RCOOH或 R1COOH，其中R或R1具有上面给出的含义，如果适宜的话存在选自如下 的共溶剂：C
3
-C
6
酮类，优选MIBK或丙酮；C
4
-C
10
羧酸酯类，优选乙酸乙 酯或乙酸丁酯；C
3
-C
6
羧酰胺类，优选DMF或二甲基乙酰胺；C
6
-C
10
芳香族 化合物，优选甲苯；和C
3
-C
7
环状碳酸酯类，优选碳酸亚乙酯、碳酸亚丙酯 或碳酸亚丁酯。 |
| 作为步骤a)中的碱性催化剂，优选使用吡啶衍生物，优选二甲基氨基 吡啶(DMAP)或羰基二咪唑。 |
| 步骤a)优选在20-100℃、特别是50-90℃的温度下进行。 |
| 作为步骤b)中的碱性催化剂，优选使用选自以下的催化剂：具有最多 48个碳原子的四烷基氢氧化铵类；碱金属或碱土金属的氢氧化物、碳酸盐、 碳酸氢盐、乙酸盐，其中碱金属是锂、钠、钾、铷或铯，碱土金属是镁、 钙或钡；具有最多36个碳原子和1-4个氮原子的叔胺；四(C
1
-C
4
-烷基)胍； 双环胺，优选DBU(1，8-重氮双环[5.4.0]十一-7-烯)和TBD(1，5，7-三氮杂双环 [4.4.0]癸-5-烯)；吡啶和强碱性离子交换树脂。 |
| 步骤b)中其他优选使用的碱性催化剂是通式NR3R4R5的三烷基胺，其 中R3、R4和R5可以相同或不同并且是直链或枝化的C
1
-C
12
-烷基，优选甲 基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基或仲丁基。 |
| 极特别优选的碱性催化剂是N(甲基)
3
、N(甲基)
2
(乙基)、N(甲基)(乙基)
2
、 N(乙基)
3
、N(正丙基)
3
、N(乙基)(异丙基)
2
或N(正丁基)
3
以及二氮杂双环辛 烷(DABCO)、DBU、TBD、六亚甲基四胺、四甲基乙二胺或四甲基胍。 |
| 同样，特别优选地，作为碱性催化剂，使用R3R4R5R6N-氢氧化物、Li-、 Na-、K-、Rb-、Cs-氢氧化物、Mg-、Ca-、Ba-氢氧化物，其中R3、R4、R5和R6可以相同或不同并且是直链或枝化的C
1
-C
12
-烷基，优选甲基、乙基、 正丙基、异丙基、正丁基或仲丁基。 |
| 作为特别优选的碱性催化剂，还使用R7R8NR9-取代的交联的聚苯乙烯 树脂，其中R7、R8和R9可以相同或不同并且是直链或任选枝化的C
1
-C
4
- 烷基，优选甲基、乙基、正丙基、正丁基。 |
| 为在步骤b)中实现快速以及尽可能完全的反应，按氢氧化物或N当量 计，使用1-20mol当量的碱，优选1-10mol当量的碱。 |
然而，如果在步骤b)中使用酸催化剂，那么有利的是使用选自pK
a
＜3 的 酸或Lewis酸的酸催化剂。 |
| 优选地，作为酸催化剂，使用HCl、HBr、HI、H
2
SO
4
、(碱金属)HSO
4
、 H
3
PO
4
、(碱金属)H
2
PO
4
、多磷酸、C
1
-C
12
-烷基磺酸、C
6
-C
10
-芳基磺酸、三氟 甲磺酸、三氟乙酸、或四氟乙烯和全氟-3，6-二氧代-4-甲基-7-辛烯磺酸(Nafion) 的共聚物，其中碱金属是锂、钠、钾、铷或铯。 |
| 然而，作为酸催化剂，还可以使用在反应完成后可以容易地分离的强 酸性离子交换树脂。 |
| 在这种情况下，优选使用交联的聚苯乙烯磺酸树脂，所述树脂任选被 取代，优选被二乙烯基苯取代。 |
| 还可以使用选自含有(WO
3
-和Cs
2
O)的氧化铝、沸石和蒙脱石的多相酸 催化剂。在所述氧化铝中，优选具有5-15％WO
3
和5-15％Cs
2
O含量的那些。 |
| 作为Lewis酸，优选使用选自AlCl
3
、ZnCl
2
、BF
3
·OEt
2
、SnCl
2
、FeCl
3
的低分子量Lewis酸。 |
| 还有利的是步骤b)中的反应在有机溶剂的溶液和/或悬浮体中进行。 |
| 作为溶剂，可以使用水和/或至少一种低分子量有机溶剂，所述有机溶 剂选自C
3
-C
6
酮，优选MIBK或丙酮；直链或枝化的C
1
-C
4
醇；C
4
-C
10
羧酸 酯，优选乙酸乙酯或乙酸丁酯；C
3
-C
6
羧酰胺，优选DMF或二甲基乙酰胺； C
6
-C
10
芳香族化合物，优选甲苯；和C
3
-C
7
环状碳酸酯，优选碳酸亚乙酯、 碳酸亚丙酯或碳酸亚丁酯。 |
| 此外，然而，还有利的是额外使用至少一种低分子量有机溶剂，所述 有机溶剂选自C
3
-C
6
酮，优选MIBK或丙酮；直链或枝化的C
1
-C
4
醇；C
4
-C
10
羧酸酯，优选乙酸乙酯或乙酸丁酯；C
3
-C
6
羧酰胺，优选DMF或二甲基乙 酰胺；C
6
-C
10
芳香族化合物，优选甲苯；和C
3
-C
7
环状碳酸酯，优选碳酸亚 乙酯、碳酸亚丙酯或碳酸亚丁酯。 |
| 步骤c)中的反应通常在90-180℃的温度下进行，优选100-160℃，特 别是120-150℃，极特别优选130-140℃。 |
| 为加速步骤c)中的水解反应，该过程还可以在酸、碱或Lewis酸催化 剂、或酸和Lewis酸催化剂的组合存在下进行。 |
| 包括本发明的生物技术和化学步骤组合的甲硫氨酸方法总体上比常规 方法更有利，特别是在所述更经济、更可靠方法的需求方面，并且可以供 应L-甲硫氨酸。 |
| 第一，使用糖代替丙烯(或丙烯醛)可以更经济地设计甲硫氨酸制备，首 先是从现有原料成本的观点来看，其次是由于独立于粗油连续增大的成本。 |
| 第二，所用糖是可再生的原料，因此对资源保护起到有价值的贡献。 此外，糖的危险远小于工业中间体丙烯醛和氢氰酸，因此用糖取代这些原 料作为起始材料显著降低了制备方法的危险，因此提高了安全性。 |
| 第三，发酵步骤的组合可以使用适合的相对温和的化学方法步骤对映 体专一性地制备L-高丝氨酸，可以将L-高丝氨酸转化成L-甲硫氨酸，而没 有外消旋化，按此方式，形成对映体纯的L-甲硫氨酸。如上所述，与目前 生产的D，L-甲硫氨酸相比，L-甲硫氨酸具有较高的生物利用度。 |
| 第四，使用上述型的组合制备方法，制备对映体纯的L-甲硫氨酸允许 开始时所提到的问题被极好地解决，而这些问题与以纯粹的生物技术方法 制备L-甲硫氨酸相关。 |
| 下面，本发明的实施例用于更详细地说明本发明，然而，不以任何方 式限制本发明。 |
| 用多相催化剂(在Al
2
O
3
载体上的7-10％WO
3
/7-10％Cs
2
O，制造商 Degussa)反应。 |
| 将L-高丝氨酸(生物技术制备的)和细研磨的多相催化剂加到高压釜中， 加入液体MeSH。高压釜随后在2.5h内加热到140℃。打开高压釜和除去 MeSH后，用20％NaOH水溶液冲洗体系。然后过滤，HPLC分析得到理论 上3％产率的L-甲硫氨酸。 |
| 比较：使用纯的Al
2
O
3
载体的相似实验仅得到痕量甲硫氨酸。 |
| 实施例2-用异丙硫醇(iPrSH)和酸/Lewis酸(不在权利要求内)的反应 |
| 用气态HBr缓慢处理iPrSH(20ml)。随后加入L-高丝氨酸(10mmol)， 搅拌混合物10分钟。然后，加入AlCl
3
(40mmol)，在室温下搅拌反应混合 物4h。使用H
2
O/HCl猝灭反应混合物，然后用NaOH调节成碱性。抽滤 Al(OH)
3
后，滤液浓缩至干，用HPLC分析。(1)的产率＝8.2％. |
| 在C-4原子上活化L-高丝氨酸并反应得到L-甲硫氨酸 |
| 冷却下将L-高丝氨酸(19.4mmol)与浓H
2
SO
4
(10ml)混合。在30分钟内 搅拌得到的反应混合物，直到高丝氨酸溶解。随后，溶液在室温下放置3 小时。然后，将反应溶液加到800ml冷却到-78℃的乙醚中，充分搅拌， 倒出上清液。每次用200ml-78℃的乙醚洗涤固体，共洗涤3次。抽滤出 白黄色固体，在油泵真空中干燥2小时。硫酸酯(2)产率：88.0％。 |
| 将硫酸酯(19mmol)溶解在DMSO(20ml)中，与NaSMe(50mmol)混合。 反应溶液在80℃搅拌，90分钟后用HPLC分析，L-甲硫氨酸的产率：19.6％。 在作为溶剂的N-甲基吡咯烷酮(NMP)中重复实验，10分钟后得到33.6％L- 甲硫氨酸。 |
| 将L-高丝氨酸(0.84mol)与600ml的浓HCl(6.1mol)混合。将溶液搅拌 约15分钟，直到所有物质溶解，随后在1.5小时内真空除去水。干燥残余 物。产率：99％的2-氨基-4-丁内酯盐酸盐。 |
| 实施例5-2-氨基-4-丁内酯盐酸盐的反应得到L-甲硫氨酸 |
| 将2-氨基-4-丁内酯盐酸盐(22mmol)加到高压釜的HCl-饱和的乙烷磺 酸(0.2mol)中，将液体形式的MeSH(0.83mol)加到该混合物中。随后密封 高压釜，在70℃加热5小时。打开高压釜和冷却后，用HPLC分析反应溶 液。L-甲硫氨酸产率为21％。 |
| 实施例6-2-氨基-4-丁内酯氢溴酸盐的反应得到L-甲硫氨酸 |
| 在高压力的高压釜中，将溴化铝(75mmol)小心加到MeSH(50ml)中。 随后，加入氨基内酯的溴化物盐(从Aldrich得到)(25mmol)。将高压釜在室 温下振动1小时，然后在40℃振动2小时。冷却并打开高压釜。除去MeSH 后，用水猝灭残余物，使用NaOH使pH成为碱性。过滤除去生成的沉淀。 甲硫氨酸产率为33％。 |
| 实施例7-2-氨基-4-丁内酯盐酸盐的反应得到2-氨基-4-甲硫基丁酸 |
| 将氨基内酯(10mmol)的氯化物盐和AlCl
3
(30mmol)加到高压釜中，与 MeSH(30ml)缓慢混合，并搅拌。随后，将混合物在室温下搅拌71小时。 用水猝灭反应混合物后，通过HPLC测定2-氨基-4-甲硫基丁酸的产率为 27％。 |
| 实施例8-2-氨基-4-丁内酯盐酸盐的反应得到2-氨基-4-异丙硫基丁酸 (不在权利要求内) |
| 将异丙硫醇(iPrSH，20ml)与AlCl
3
(30mmol)混合并搅拌。随后加入氨 基内酯的氯化物盐(10mmol)，混合物在室温下搅拌24小时。用水猝灭反应 混合物后，通过HPLC测定2-氨基-4-异丙硫基丁酸的产率为77％。 |
| 实施例9-2-氨基-4-丁内酯盐酸盐的反应得到L-甲硫氨酸 |
| 将2-氨基-4-丁内酯盐酸盐(70mmol)和TBD(1，5，7-三氮杂双环[4.4.0]癸 -5-烯)(140mmol)加到高压釜中，加入液体MeSH。2.5小时内将密封的高压 釜加热到70℃。随后温和冷却高压釜并打开。除去MeSH，用HPLC分析 残余物。L-甲硫氨酸产率为21％。 |
| 实施例10-环化L-高丝氨酸和N-酰化得到N-酰基-2-氨基-4-丁内酯， 和进一步反应得到N-酰基-L-甲硫氨酸(L-甲硫氨酸的前体) |
| 将L-高丝氨酸(2mol)悬浮在900ml乙酸酐中，并与一刮勺尖的二甲基 氨基吡啶(DMAP)混合。缓慢加热到60℃。约1小时后，温度快速升至100℃。 随后反应混合物在80℃搅拌90分钟，真空浓缩至干。用异丙醇(600ml)中 吸收得到的黄色油，在0℃放置过夜。过滤得到的晶体，用冷的异丙醇洗 涤，真空干燥。分离出的N-乙酰基-2-氨基-4-丁内酯的产率为60％，纯度为 99％(根据HPLC)。 |
| 随后使N-乙酰基-2-氨基丁内酯(1eq)在MeSH中与各种碱反应，得到 N-乙酰基甲硫氨酸。在密封的高压釜中加热N-乙酰基氨基内酯、碱和 MeSH(14eq)的混合物。冷却、打开高压釜和除去MeSH后，用HPLC分析 残余油。下表中列出了进一步细节以及得到的N-乙酰基-L-甲硫氨酸的产 率： |
| 碱/ 相对于原料的 温度 时间 N-乙酰基-L-甲硫 |
| 情况a)-e) 当量 (℃) (h) 氨酸的产率(％) |
| ** 1，5，7-三氮杂双环[4.4.0]癸-5-烯 |