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1. CN102159931 - Method and apparatus for the simultaneous, automated decomposition of a plurality of biological samples

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[ ZH ]
用于同时自动破碎多个生物样品的方法和装置


发明领域
本发明涉及用于破碎植物或动物样品进行处理的方法和装置,例如从样品分 离核酸或蛋白质。这些制备和测试在实验室中通过实验室技术按照标准化的处理指 令进行。所谓规程是这种处理指令的一部分。这种用于从大肠杆菌(E.coli)分离质粒 的规程的一个例子可以从文献DE 101 53 957A1了解。
技术背景
为了按所需方式处理样品,即,分离核酸或蛋白质,例如根据样品和所需结 果,可以从市场购得所谓“试剂盒”,例如恰根公司(Qiagen)的“超净组织DNA分离 试剂盒(UltraClean Tissue DNA Isolation Kit)”( www.Qiagen.com )。在使用这种试剂盒 按照预先确定的规程处理样品之前,必须以合适的方式对样品进行制备。
以下描述这些现有技术已知的典型制备方法。
例如,从实验动物如大鼠取出器官。动物器官的选择取决于目的。在洗涤缓 冲溶液如PBS(磷酸盐缓冲盐水,具有以下组成:Na 2 HPO 4 (干燥的)、NaH 2 PO 4 (干燥 的)、NaCl和蒸馏水)中对取出的动物器官或组织进行洗涤。由于洗涤过程,取出的 组织部分以无血状态提供,而且没有不利的组分。
然后,将取出的组织在液氮中冷却,以停止细胞活动等。否则,将不能在处 理之后以所需质量获得所需的信息。在该过程中,通常将具有体温例如37℃的组 织浸没在液氮中。将产生气泡。直到气泡停止形成才将组织从液氮中取出。然后使 用例如干冰将组织储存在-80℃。
如果要避免在液氮中的冷却步骤,则作为替代,在洗涤过程之后,使用稳定 化试剂如RNAlater对取出的组织进行化学保存。RNAlater是一种粘性液体,由 Ambion公司开发( www.ambion.com )用于保存新鲜组织。该保存效果主要基于通过除 水使组织中所有的酶失活,以及基于停止细胞活动。该粘性液体必须迅速扩散到组 织的所有细胞中。因此,组织片的尺寸必须限于边长最多为0.5厘米。化学处理之 后,经过如此处理的组织也在-80℃冷却,以在处理之前对其进行储存。
对于处理而言,通常需要10-100毫克组织以进行所需测试、分离等。在处理 之前,使用例如解剖刀切下所需量的动物组织。
上述样品制备步骤可以单独或组合地作为下述本发明的特征。
对切割的样品即切割的组织进行破碎,意味着必须打开细胞壁。这种操作可 以通过机器、化学或酶方式进行。机器破碎可以例如使用恰根公司的“TissueRuptor” 进行(参见TissueRuptor手册,2006年7月,恰根公司(Qiagen),德国希尔敦(Hiden  Germany)了解)。在这种情况中,旋转刀片以35000转/分钟的速度使组织的细胞壁 分解。机械破碎通常在缓冲剂中进行,以避免破坏成分如核酸。
在缓冲剂(即一种化学物质)存在下在容器中进行的机械破碎在文献EP  1577011A2中描述。
在低温研磨机中制备样品也是已知的(参见例如http: //www.laborpraxis.de/fachartikel/lp_fachartikel_nh_2384859.html,2007年3月12日)。 在这种主动冷却的研磨机中,在液氮温度下对样品进行研磨。样品在整个研磨过程 中保持深度冷冻,而不与氮接触。这种技术上相当复杂的方法可以在上述方法失败 的那些样品情况中进行,例如在材料非常硬的情况中,例如骨头,或者在材料含胶 原的情况中,例如皮肤。如果要制备骨头样品,则将其放置在充满液氮的容器中, 使用金属钉将其压碎。然后提供粉末形式的骨头。
如果要用显微镜进行组织学测试,则首先用石蜡浸渍样品,使其变硬,然后 使用显微镜切片机切割成组织薄层。
如果要处理植物样品,则只有在软材料(如叶、软豆等)的情况中才能用解剖刀 将它们切割成一定尺寸。在干燥的或冷冻的植物样品的情况中,它们被冷冻在液氮 中,在用液氮主动冷却的研钵中使用研杵进行研磨。
德国专利说明书738 286说明了将细胞与分散液体一起进行冷冻和研磨,从而 分解细胞。
从文献DE 602005001256T2和WO 2004/082837A1了解了用于食品如香料的 压碎/混合装置。该装置包括中空体,该中空体中放置一个球,使用该球压碎食品。
文献US 2004/0144874A1、JP 2006051505A、JP 2002-066 366A和JP 03-186  360A揭示了用于球磨机和同类可比装置的其他例子。从这些文献不能了解破碎生 物样品的方法。
发明概述
以上述方式制备样品的目的是在处理之后获得尽可能好的所探寻的结果。因 此,本发明的目的是适当且简单地破碎生物样品。
一种达到该目的的解决方案包括权利要求1的特征。一种用于进行该方法的 装置包括独立权利要求的特征。通过从属权利要求了解有利的实施方式。
将适当制备的样品插入塑料构成的容器中。将该塑料容器插入适配器中。然 后密封该塑料容器。可以用适配器的盖子进行密封。但是优选塑料容器具有其自身 的盖子,因此即使在破碎过程之后从适配器中取出塑料容器时,该塑料容器仍然是 密封的。而且,如果塑料容器不再使用而是最后丢弃,则使清洁努力最小化。随后 将适配器与使其自动往复(尤其是上下往复)的设备相连,从而破碎样品。具体来说, 以一定方式对适配器进行设置,使其能够容纳大量塑料容器,从而能同时破碎大量 生物样品。
在插入塑料容器之前,样品经过适当制备,具体是首先洗涤样品,然后使用 液氮进行保存或进行化学保存,即,例如使用美国公司Ambion,弗斯特城(Foster  City)的RNAlater或者根据网页http: //www1.qiagen.com/products/RnaStabilizationPurification/AllprotectTissueReagent.asp x使用恰根公司(Qiagen)的AllProtect进行。主要根据塑料容器的尺寸,将适当制备 的样品全部或部分地装入塑料容器中。如果只装入一部分样品,则使用例如解剖刀 将该部分切除。
因为在化学保存的情况中,待保存样品必须比较小,优选对塑料容器的尺寸 进行设计,使其只能容纳小样品。因此,如果出于这个原因总是只能制备优选不超 过50毫克、更优选不超过30毫克的少量样品,则可以以改进的方式避免操作误差。
该方法能自动破碎样品,即以不同方式自动破碎样品。通过首先将经过冷冻 或化学保存的样品放置在密封的处于插入状态的塑料容器中,由此避免整体装置的 其他成分污染。该塑料容器是一种便宜的可丢弃的制品,在样品破碎之后,不一定 需要因为经济原因而再使用。因此,可以省去对用过的塑料容器的清洁。由于适配 器能容纳大量其中放置了样品的塑料容器,所以可以同时破碎大量样品。
从根本上说,另一方面,适配器是能从设备分离的部件,从而能够适当且简 单地制备适配器。具体来说,在该情况中,在将样品插入塑料容器中之前,可以简 单地将适配器冷却到一定的温度范围,具体是-20℃到-80℃,例如在冷冻箱中进行 冷却,或者使用干冰进行冷却,从而能破碎冷冻的样品,而无须担心样品解冻,即 使在缺少主动冷却的条件下也无须担心。
根据权利要求的内容可以用于植物也可以用于动物或人的组织,用于植物或 组织的稳定化的以及新鲜的样品。此外,可以在室温下以非常简单的方式进行破碎, 对于化学保存的样品,以及对于在低温冷冻的样品,都是如此。
为了能可靠地在破碎过程中保持冷冻的样品处于适当冷却条件下,在一种实 施方式中,适配器包括一个、优选若干个金属套,该金属套插入塑料容器中。除此 以外,适配器全部或至少主要由塑料构成。金属套具有在足够长的时间内保持塑料 容器冷却所需的热容。此外,适配器全部或至少主要由塑料构成,因此,适配器不 会太重,否则会使其操作变得困难得多。
在本发明的一种实施方式中,将深度冷冻的样品放置在冷却的塑料容器中, 该容器中另外包含至少一个可移动的硬体。然后将冷却的塑料容器插入冷却的适配 器中,或者插入冷却的适配器的金属套中。在一种实施方式中,适配器冷却的温度 应当低于-50℃,从而可靠地防止冷冻的样品在破碎过程中解冻。优选温度约为 -80℃,例如应当选择为-70℃到-90℃。可以使用干冰或者在冷冻箱中以成本有效的 方式提供-80℃或者-70℃到-90℃的温度。发现通过冷却到约-80℃能获得特别优良 的结果。在某种程度上,低于-80℃的温度也是可能的。但是,应当注意适配器不 能过度冷却,否则将无法进行破碎。例如,已经证明液氮温度(即-196℃)太低,不 能获得优良的结果。然后,插入设备中之后,使适配器非常迅速地往复运动,从而 使可移动体相对于塑料容器以一定方式振摇,可移动体将深度冷冻的样品压碎并破 碎。已经证明,例如通过氮对适配器进行额外的主动冷却是不必要的,因此优选不 提供。这使得与破碎过程中需要主动冷却的现有技术相比,操作变得简单得多。
特别合适的情况是,塑料容器的圆筒形内部具有至少一个中空球形状的端部。 在这种情况下,可移动体优选是球或具有球形端部的销。球或销的直径略小于塑料 容器内部的直径,从而确保移动性。可移动体由硬质材料、优选是重质材料构成, 例如金属,从而能压碎样品。优选以一定方式将样品引入塑料容器中,将其放置在 塑料容器的中空球形端部和球或销之间。球或销的直径优选至少为5毫米,更优选 至少为8毫米。塑料容器的直径优选不超过15毫米,优选最大为10毫米。优选塑 料容器在破碎过程中垂直设置,中空球形端部位于底部。由于重力的原因,样品材 料主要保持在较低的区域中,因此,只要一个(较低的)中空球形端部就足以使用球 可靠地进行压碎。
具体来说,将冷却到至少-50℃的样品放置在塑料容器中。然后振摇该容器, 具体来说,使用设备以一定方式振摇10-200秒,使可移动体来回运动,优选上下 运动,优选运动频率为10-100赫兹,具体来说,频率至少为30赫兹。如果振摇或 往复运动时间太长,则样品有解冻的风险。为了能可靠地在可用时间内破碎样品, 往复过程应足够长且频率足够高。由此,将样品压碎,从塑料容器中取出,按照规 程使用试剂盒对所需量的样品进行处理。除了冷冻的样品和一个或多个可移动的硬 体以外,容器中基本上没有其他物质,尤其是没有冷却剂(如液氮)或例如缓冲溶液。 这些其他物质至少在通常情况下只会对所需结果造成掺假。
令人吃惊的是,发现与本领域已知的样品制备法相比,这种形式的对冷冻试 样的破碎能获得非常优良的结果,而且不需要进行大的技术改进,操作也很简单。 可以省去在例如TissueRupter中的破碎,因为这种额外的破碎基本上是不需要的。 由此制备的样品可以立刻进行处理,给出特别优良的结果。技术改进要求不高,因 为只有包括可移动体的容器和其中放置的适配器需要冷却,例如在冷冻箱中冷却到 例如-50℃到-80℃的温度。将样品压碎之后,可以将其取出,例如储存在另一个容 器中并进行冷却,供以后使用。或者,不需要取出样品并储存在另一个容器中,而 是仍然在包括可移动体的塑料容器中进行。在该情况中,该容器同时用作破碎容器 和储存容器。可以精确且简单地决定处理所需的样品量。另外,在该过程中可以实 现同种组织分配。甚至可以制备稳定化的组织、植物的叶和种子,以这种方式进行 进一步处理。但是,这种方法并不适合皮肤和骨头以及比较硬或粘的样品。
由于在冷却的密封适配器中进行处理不需要很长时间,所以不需要中断振摇 过程和在间歇时间内将适配器冷却到适当的低温。如果适配器具有壁足够厚的金属 套,这样做是特别有利的。一般来说,壁厚几毫米就足够了。在一种实施方式中, 壁的厚度至少为0.5毫米,从而提供足够的热容,优选至少为1毫米。为了不至于 变得太重,在一种实施方式中,壁厚不超过4毫米。
由于压碎之后,样品以粉末形式提供,所以使样品具有特定的大表面积是有 利的,随后可以在该大表面积上与使用的化学物质发生作用。可以以特别简单的方 式为随后的步骤提供所需量的粉末,例如通过称量提供,或者甚至通过相应尺寸的 测量容器(例如量匙)提供。
适配器本身适合于以非冷却的状态破碎未冷却的样品。但是,在这种情况中, 样品通过分解缓冲剂的方式进行破碎,在破碎过程中,该分解缓冲剂与样品一起位 于塑料容器中。当适配器以非冷却状态使用时,也对样品进行压碎。在这种情况中, 产生缓冲剂和组织的溶液。合适的分解缓冲剂包括含有用于破碎DNA的络合剂和 表面活性剂的缓冲剂,例如,从德国希尔敦的(Hilden,Germany)恰根公司(Qiagen  GmbH)购得的分解缓冲剂ATL,或者缓冲剂包含用于破碎RNA的离液剂,例如从 恰根公司(Qiagen GmbH)购得的分解缓冲剂RLT。
将之前称量的组织片在冷却状态中处理成粉末之后,在一种实施方式中加入 缓冲剂,即将粉末转移到溶液中。由此避免困难的操作,从而再次取出非常少量的 样品,例如10毫克组织粉末。
如果对组织进行破碎,则优选对破碎使用位于塑料容器中的较大的金属可移 动体。如果对细菌进行破碎,则较小的可移动体主要由玻璃构成(所谓玻璃珠)。玻 璃珠具有较小的直径,类似砂。由此,摩擦变得强得多。这些性质是需要的,以便 对细菌进行破碎。一般来说,金属珠太大,因此单个球之间的距离产生的间隙太大, 从而无法破碎细菌。
作为上述实践的代替方式,还可在原则上选择不同的非金属材料,尤其是能 与塑料相近的材料。但是,塑料是特别优选的。
通过以下对实验的说明,其他优点和实施方式将是显而易见的。
图1显示通过适配器1的横截面。适配器1包括容器形状的基体2,该基体被 盖子3密封。在该基体中,设置了总共12个套4(在俯视图中看),这些套由铝构成, 在适配器中轴周围以圆形方式设置。套4的壁厚度为1毫米。套4的上部区域中具 有一个或多个缝5。有缝的上部区域通过夹具固定在插入件2a中,插入件位于基 体2中。因此,可以为了清洁的目的从基体2取下套4,尤其是与插入件2a一起 简单地取下。
图1显示有盖的塑料容器6,其插入金属套4中。塑料容器6被夹在两个发泡 硅酮的弹性环状盘7之间,该盘7设置在塑料容器6的下方和上方。上部环状盘通 过盖子3以设置在盖子3下侧的横向沟槽的方式固定。下部环状盘7通过横向沟槽 固定在基体2的底部上。弹性盘7在破碎过程中使容器稳定化,因此不会破损。此 外,弹性盘7具有降噪效果。
由塑料构成的容器6的底部是中空球形的。在容器6中存在钢构成的球8。将 生物样品9放置在钢球8和塑料容器6的中空球形底部之间。只需要塑料容器6 的底部是中空球形的就足够的,而对其盖子区域没有这种要求,由于重力的原因, 样品将至少主要保持在较低的部分中,因此样品在底部区域中被压碎。
在其上半部,基体2具有钢质螺线插入件10,该插入件中螺旋连接有盖子3 的紧固螺丝11,从而用盖子密封基体。转四分之一圈就足以紧固盖子。在下半部 中有另一个钢质螺线轴衬12,该轴衬中螺旋连接有螺丝13,从而使螺丝13的螺线 在容器2的底部区域上突出。而且,螺丝13用胶粘剂紧固,反面连接了螺母14, 这种连接非常可靠,不会使这种紧固状态松脱。
螺丝13向下突出的那部分螺线用于将适配器1以可松脱的方式紧固于设备, 从而使适配器能以振动方式上下移动,用球8将样品9压碎并使其破碎。
而且,基体2由塑料(即聚甲醛)构成。这种塑料能承受约-80℃的低温,以及 普通的清洁溶液。由聚甲醛构成的环状插入件2a在基体2的上部区域中受到硅酮 O形环15的支承,该O形环的肖氏硬度为50,并通过盖子3通过夹具固定。将金 属套的上部区域夹在插入件2a中。因此,由硅酮构成的环能降噪。但是,还可选 择其他符合上述要求的塑料。
盖子3和插入件2a通过弹性中间层互相分开,从而进一步降低破碎过程中的 噪声。中间层还可以是硅酮环。
插入件2a包括向上的突起,居中设置的夹钳16,从而能使插入件14与套和 其中悬挂的塑料容器一起移动。为了能适当地悬挂塑料容器,其上部部分中具有较 宽的轮缘,其宽度大于套4的内部直径。在所示的示例性实施方式中,套的上部部 分具有加宽的内部直径,从而能容纳塑料容器的加宽的轮缘。如果插入件2a与塑 料容器6一起取出,则塑料容器的加宽的上部轮缘能进入内部直径放大的套的相应 上部凹陷中,然后在运输过程中特别牢固地固定。
图1中所示基体的直径约为80毫米。基体高度约为50毫米。金属套4的内 部直径为11毫米。这种套4的高度为35毫米。相应尺寸的塑料容器6方便地装有 约25毫克样品材料作为标准。
上述尺寸和适配器材料仅仅是优选情况,无须强制选择。同样适用于所示适 配器的设计。
图2显示一个台架,其上可以放置插入件2a以及悬挂的塑料容器6和套。台 架的圆筒形凹陷18用于容纳套4和塑料容器6。钻锥19用于将塑料容器从套中推 出,从而能简单地取出塑料容器。台架17的向上突起夹钳20推过插入件2a的中 央开口,从而将插入件2a放置在台架17上。
实施例
以下实验使用图1中所示的适配器进行。
1.从新鲜大鼠肝脏和新鲜大鼠心脏分离DNA
分别将12个新鲜大鼠肝脏和心脏的样品(25毫克)加入180微升ATL(即包 含络合剂和表面活性剂的缓冲剂,从恰根公司(Qiagen GmbH),德国希尔敦 (Hilden,Germany)购得(参见网页http: //www1.qiagen.com/Products/Accessories/Buffers/BufferATL.aspx))和10微升 DX(参见网页http://www1.qiagen.com/Products/ReagentDX.aspx)中,使用两个 金属不锈钢球(也称为“珠”),其直径为5毫米,以50赫兹的频率破碎1.5分钟。 测试显示,在两个珠的情况中,紊流较大,导致组织研磨程度较高。因此,通 过设备以50赫兹的频率上下移动适配器。然后取出样品,用小的台式离心机 离心。破碎过程之后,将适配器夹在这种台式离心机中。然后打开离心机短时 间周期,再次使所有成分来到适配器的底部。
然后加入20微升蛋白酶K,进行旋流,将溶液在56℃培养1小时。培养 之后,向样品中加入4微升RNAse A(100毫克/毫升),培养5分钟。其他步骤 按照DNeasy规程进行(参见网页http: //www1.qiagen.com/Products/GenomicDnaStabilizationPurification/DNeasyTissue System/DNeasyBloodTissueKit.aspx)。
结果:
心脏:
心脏组织给出平均5.83微克DNA和1.07的标准偏差。分离的DNA质量 可以略高,但是对于该结果没有抱怨。
肝脏:
肝脏组织给出平均34.08微克DNA和10.97的标准偏差。肝脏组织的破碎 显示,破碎工作非常优良。
2.从新鲜的牛肝脏分离DNA
分别将12个样品(25毫克)的新鲜牛肝脏加入180微升ATL和6微升DX 中,使用两个珠,以50赫兹的频率破碎2分钟。然后取出样品,并离心。然 后加入20微升蛋白酶K,进行旋流,将溶液在56℃培养1.5小时。培养之后, 向样品中加入4微升RNAse A(100毫克/毫升),以室温培养5分钟。其他步骤 按照德国希尔敦得恰根公司(Quiagen,Hilden,Germany)的QIAcube组织和啮 齿动物尾巴规程进行。组织和啮齿动物尾巴规程与QIA cube一起装运。
结果:
肝脏:
肝脏组织给出平均44.38微克DNA和12.84的标准偏差。对肝脏组织的破 碎再次显示,破碎工作非常优良。DNA同样可以作为白色卷状物看到,使用移 液管将其转移到新的MRV中比较困难(MRV=微反应容器,或简称为“eppi”)。
一般来说,预计有20微克DNA。较高的44.38微克的DNA平均值表明, DNA进行了进一步的分解。小的碎片导致测量中产生较高的信号,会造成浓度 较高的错误指示。