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1. (WO1998003653) METHOD FOR PREPARING TRANSGENIC NON-HUMAN MAMMALIAN ORGANS FOR TRANSPLANTATION TO HUMANS, AND NUCLEOTIDE SEQUENCES THEREFOR
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PROCEDE DE PREPARATION D'ORGANES DE MAMMIFERES NON HUMAINS TRANSGENIQUES EN VUE DE LEUR TRANSPLANTATION CHEZ L'HOMME, ET SEQUENCES NUCLEOTIDIQUES POUR LA MISE EN OEUVRE DE CE PROCEDE

La présente invention a pour objet l'utilisation de séquences nucléotidiques pour la mise en oeuvre d'un procédé de préparation d'organes de mammifères non humains transgéniques susceptibles d'être greffés chez l'homme en réduisant sensiblement les risques de rejet de greffes.
La transplantation d'organes animaux chez l'homme, ou xénotransplantation, est une technique considérée actuellement comme une alternative possible, permettant de pallier le manque crucial de donneur en allogreffe. Des avancées spectaculaires dans ce domaine ont été réalisées depuis quelques années, et le porc comme animal donneur s'impose à la communauté scientifique et médicale. Les raisons de ce choix, par opposition au choix de primates comme donneurs d'organes sont multiples: le risque de transmission de virus pathogènes pour l'homme est bien moindre à partir du porc (Allan, 1996), l'élevage et le temps de reproduction des primates, à l'opposé du porc, rend leur utilisation difficile, et une barrière d'ordre éthique non négligeable existe pour l'utilisation de singes à des fins de médecine humaine. L'obstacle majeur à l'utilisation de greffons de porc chez l'homme est avant tout immunologique: l'homme possède des anticorps naturels (appelés xénoanticorps naturels-XAN-) dirigés contre des molécules exprimées par les cellules porcines. Lorsqu'un organe de porc est greffé chez l'homme (et chez les primates supérieurs qui possèdent aussi ces anticorps), ces anticorps réagissent avec l'endothélium vasculaire entraînant un rejet suraigu de l'organe. Il s'agit en fait de la perte, induite par les XAN et le complément, de l'intégrité de l'endothélium vasculaire entraînant un oedème, une infiltration cellulaire et une destruction de l'organe (Bach et al., 1995). Les antigènes porcins reconnus par les XAN ont été analysés: il s'agit majoritairement d'une structure glucidique constituée de galactose branché en configuration α1 ,3 sur le N-acétyllactosamine (épitope α-galactosyl) présent sur les glycolipides et les glycoprotéines de membrane

(Sandrin et al., 1993).

Les travaux réalisés par l'équipe de D White (Cambridge) ont permis de rèsoudre partiellement ce problème de rejet hyperaigu en bloquant l'activation du complément humain à la surface des cellules de l'endothélium porcin (Carrington et al, 1995), ils sont parvenus à rèaliser des greffes de coeur de porc chez le macaque, dont la survie semble similaire à la survie d'une allogreffe (greffe d'un organe de la même espece) rèalisée dans les mêmes conditions, dans la mesure où le dépôt de XAN n'est pas trop massif. Techniquement, cela a été réalisé par insertion, par transgenése germinale, d'une molècule régulatrice du complément humain, le DAF (pour decay accelerating factor, ou CD55), dans le génome de porc. Cette molècule, spècifique d'espèce, empêche la C3 convertase humaine d'enclencher la réaction en chaîne d'activation du complément à la surface des cellules porcines. Cette molécule semble toutefois " dépassée " lorsque la quantitè de complèment fixée est trop importante Dans ce cas, un rejet survient quand même.
La présence des épitopes α-galactosyl, le xenoantigéne majeur sur les cellules porcines, est due à l'action d'une enzyme golgienne, UDP-Gal:Ga1α1-4GlcNacα1,3-galactosyltransférase (encore dèsignèe enzyme α1 ,3GT) . L'enzyme α1,3GT participe à la fixation de galactose, en configuration α1 ,3, sur le galactose du N-acétyllactosamine des glycoprotéines et glycolipides membranaires, ce qui crée un épitope xenoantigénique appelè α-galactosyl constitué de l'ensemble Galα1,3Gal-N-acétyllactosamine. L'inactivation du gène codant pour cette enzyme chez le porc pourrait bloquer la synthèse des èpitopes α-galactosyl et induirait la non reconnaissance des cellules de porc par les XAN humains. Cette inactivation, utilisèe conjointement à l'expression de DAF humain chez le porc, pourrait reprèsenter un bènéfice décisif pour la rèussite de la xénogreffe d'organes de porc chez l'homme. Cependant, l'inactivation d'un gène par recombinaison homologue ("gene knock out") est une technique dont l'utilisation est actuellement restreinte à la souris, car sa mise en oeuvre nècessite la disponibilité de cellules souches embryonnaires, dites cellules ES. Ces cellules, malgré d'intenses recherches, n'ont jamais pu être obtenues chez une autre espèce que la souris. L'inactivation de l'α1 ,3GT chez le porc ne peut donc pas être rèalisèe par cette technique.
A part les molécules xénoantigeniques et les molècules participant a la biosynthese de ces dernières, il existe d'autres molècules dont l' inhibition pourrait être utile en xénotransplantation, en particuher les molècules dont l'activitè biologique concourt au rejet de greffe, sans que ces molècules ne soient des xenoantigenes ou ne participent à la synthèse de xenoantigenes. II s'agit notamment de l'ensemble des molécules à caractère inflammatoire produites par l 'endothélium du greffon, en particulier lors d'une xénogreffe : cytokmes (IL- 1 , IL-6), facteurs chémotactiques (IL-8. IP- 10, RANTES, MCP/JE, inhibiteurs p15E, GFM-CSF, G-CSF), molécules d'adhésion (ELAM-1 , VCAM-1 , ICAM-1 , c-sis, GPlbα, vWF, ligand LAM-1), facteurs de transcription (c-fos, NFkB, Gem), régulateurs du tonus vasculaire (iNO synthase, PGH synthase, endothéline), facteurs intervenant dans la coagulation (PAF acétyltransférase, facteur tissulaire, PAI-1), facteurs d'immunocompétence (CMH 1, CMH II). Il s'agit aussi des récepteurs, exprimés par l'endothélium du greffon, à des molécules provenant du receveur et ayant une activité biologique concourant au rejet de greffe : récepteur au C5a, récepteur au TNFα, récepteur à l'INFγ, récepteurs aux cellules NK.
La présente invention a pour but de fournir des organes de mammifères non humains transgéniques susceptibles d'être greffés chez des patients nécessitant une greffe d'organes, avec diminution du risque de phénomène de rejet du greffon, voire complète annulation de ce risque.
La présente invention a également pour but de fournir des séquences nucléotidiques susceptibles d'être utilisées pour la transformation génétique d'animaux en vue d'obtenir les susdits organes.
L'invention a également pour but de fournir des mammifères non humains transgéniques à partir desquels sont susceptibles d'être prélevés les susdits organes.
La présente invention a pour objet l'utilisation de séquences nucléotidiques codant pour des anticorps dirigés contre toute molécule impliquée dans un phénomène de rejet de greffe (encore désignés ci-après anticorps anti-molécules), et notamment contre toute molécule possédant une activité telle que ladite molécule représente un épitope xénoantigénique, ou participe à la biosynthèse d'épitopes xénoantigéniques dans des cellules de mammifères non humains (et plus particulièrement à la surface de ces cellules), ces épitopes étant susceptibles d'être reconnus par des xénoanticorps naturels humains lorsque lesdites cellules, ou organes constitués de ces cellules, de mammifères non humains, sont greffés chez l'homme, pour la préparation de cellules transgéniques, ou organes transgéniques, de mammifères non humains, au sein desquels lesdites molécules forment en totalité ou en partie des complexes immuns avec lesdits anticorps anti-molécules, de telle sorte que l'activité desdites molécules dans les phénomènes de rejet de greffe soit totalement ou partiellement inhibée, en particulier que les xénoanticorps susmentionnés ne teconnaissent plus, en totalité ou en partie, les susdits épitopes, ou au sein desquels la biosynthèse desdits épitopes xenoantigeniques est partiellement ou totalement inhibée, lesdites cellules ou lesdits organes transgéniques de mammifères non humains étant destinés à être greffés chez un patient.
Les séquences nucléotidiques utilisées dans le cadre de la présente invention sont avantageusement celles codant pour des anticorps dirigés contre :

- tout épitope xénoantigénique, glucidique ou non glucidique, reconnu par des xénoanticorps humains, et plus particulièrement les épitopes glucidiques galactosylés situés à la surface des membranes de cellules de mammifères non humains, notamment l'épitope α-galactosyl présent à la surface de cellules de porc et constitué de l'ensemble Galα1 ,3Gal-N-acétyllactosamine susmentionnè,

- toute molécule participant à la biosynthèse d'épitopes xénoantigéniques chez l'homme, de nature glucidique ou non glucidique, et plus particulièrement les galactosyltransférases présentes dans les cellules de mammifères non humains, notamment l'enzyme α1,3GT présente dans les cellules de porc,
- toute molécule à caractère inflammatoire synthétisée dans l'endothélium de mammifères non humains, et dont l'activité biologique conduit notamment à la modification des propriétés anticoagulantes de l'endothélium in vivo en milieu xénogénique, telle que les cytokines et chemoattracteurs (IL-1 , IL-6, IL-8, IP-10, RANTES, MCP/JE, inhibiteurs pl5E, GM-CSF, G-CSF), les molècules d'adhésion (ELAM-1 , VCAM-1 , ICAM-1 , c-sis, GPlbα, vWF, ligand LAM- 1 ) les facteurs de transcription ou modifiant la transcription (c-fos, NFkB, Gem), les régulateurs du tonus vasculaire (iNO synthase, PGH synthase, endothéline), les facteurs intervenant dans la coagulation (PAF acétyltransférase. facteur tissulaire, PAI-1), les facteurs d'immunocompétence (CMH I, CMH II),
- les récepteurs membranaires à des molécules présentes chez le receveur, l'action de ces molécules étant dirigée vers un rejet de greffe, dont par exemple le C5aR, ou le TNFαR, ou les récepteurs aux cellules NK.
L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation de molécules impliquées dans un phénomène de rejet de greffe, telles que décrites ci-dessus, pour la mise en oeuvre d'un procédé d'obtention, notamment selon les méthodes décrites ci-dessous, de séquences nucléotidiques codant pour des anticoips dirigés contre les susdites molécules, ces séquences nucléotidiques étant ellesmêmes susceptibles d'être utilisées pour la préparation de cellules transgéniques, ou d'organes transgéniques tels que définis ci-dessus selon l'invention.
Avantageusement, les séquences nucléotidiques utilisées dans le cadre de l'invention sont obtenues par sélection des susdits anticorps anti-molecules à savoir des anticorps dirigés contre les molécules impliquées dans un phénomène de rejet de greffe, cette sélection étant effectuée à l'aide desdites molécules utilisées en tant que molécules cibles reconnues par lesdits anticorps, et séquençage des séquences nucléotidiques codant pour lesdits anticorps ainsi sélectionnés.
Lesdits anticorps anti-molécules sont eux-mêmes avantageusement obtenus à partir de tout hybridome susceptible d'être formé, par des méthodes classiques, à partir de cellules spléniques d'un animal, notamment de souris ou de rat, immunisés contre l'une desdites molécules impliquées dans un phénomène de rejet de greffe, d'une part, et des cellules d'un myélome approprié d'autre part, ledit hybridome étant sélectionné par sa capacité à produire des anticorps monoclonaux reconnaissant ladite molécule initialement mise en oeuvre pour l'immunisation des animaux.
L'ADN des hybridomes ainsi sélectionné est ensuite clone, selon les techniques bien connues de l'homme de métier, dans des hôtes cellulaires susceptibles de produire lesdits anticorps monoclonaux, les séquences nucléotidiques codant pour lesdits anticorps ainsi sélectionnés, étant ensuite séquencées.
Lesdits anticorps anti-molécules peuvent également être obtenus par criblage d'une banque d'anticorps (telle que la banque décrite dans l'article de

Nissim et al., 1994) avec lesdites molécules, ladite banque d'anticorps étant construite à partir de séquences d'ADN d'immunoglobulines humaines ou murines, ou issues d'une autre espèce, dans un hôte cellulaire (notamment dans des phages) susceptibles d'exprimer les anticorps codés par lesdites séquences d'ADN d'immunoglobulines.
Avantageusement, les anticorps susmentionnés, à partir desquels sont déduites les séquences nucléotidiques utilisées dans le cadre de la présente invention sont des anticorps simple brin (encore désignés anticorps ScFv).
Ces anticorps ScFv sont avantageusement obtenus à partir d'une banque d'anticorps telle que décrite ci-dessus, dans laquelle les séquences d'ADN codant pour ces anticorps sont traitées, notamment selon la méthode décrite dans l 'article de Nissim et al., 1994, de manière à obtenir des anticorps simple brin, notamment par jonction de tout ou partie d'une séquence d'ADN codant pour une chaîne lourde d'immunoglobuline avec tout ou partie d'une séquence d'ADN codant pour une chaîne légère d'immunoglobuline.
Ces anticorps ScFv peuvent également être obtenus par clonage de l'ADN complémentaire (ADNc) issu d'hybridomes, tels que décrits ci-dessus, codant pour une immunoglobuline dirigée contre une desdites molècules impliquèes dans un phénomène de rejet de greffe, suivi d'un traitement, tel que décrit ci-dessus, de manière a obtenir des anticorps simple brin par jonction de tout ou partie de la fraction dudit ADNc codant pour la chaîne lourde de l'immunoglobuline avec tout ou partie de la fraction dudit ADNc codant pour la chaîne lègère de cette immunoglobuline.
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, les séquences nucléotidiques utilisées pour la préparation de cellules ou organes transgèniques susmentionnés, sont celles codant pour des anticorps diriges contre toute molècule impliquèe dans la biosynthesc d'épitopes xenoantigeniques dans les cellules de mammifères non humains.
Avantageusement, les séquences nucléotidiques utilisées dans le cadre de la prèsente invention sont celles codant pour des anticorps diriges contre 1 une au moins des isoformes (et avantageusement contre toutes les isoformes) des galactosyltransférases présentes chez les mammifères non humains, et plus particulièrement contre l'une au moins des isoformes de l'α1 ,3GT prèsente chez le porc, pour la préparation d'organes de mammifères non humains transgéniques au sein desquels la biosynthèse des èpitopes α-galactosyl dans les cellules desdits organes est partiellement ou totalement inhibèe.
A ce titre, l'invention a plus particulièrement pour objet les anticorps, le cas échéant simple brin, dirigés contre l'une au moins des isoformes de l'α1 ,3GT lesdits anticorps étant tels qu'obtenus par mise en oeuvre d'une des mèthodes décrites ci-dessus effectuées à l'aide d'une ou plusieurs isoformes de l'α1 ,3GT, en tant que molécules impliquées dans un phénomène de lejet de greffe.
L'invention concerne plus particulièrement les anticorps tels que dècrus ci-dessus, dirigés contre l'une au moins des isoformes de l'α1 ,3GT prèsentes chez le porc, et notamment contre l'une au moins des isoformes reprèsentèes par les séquences en acides aminés SEQ ID NO 2 (correspondant a l'isotorme 1 ), SEQ ID NO 4 (correspondant à l'isoforme 2), SEQ ID NO 6 (correspondant a l'isoforme 3) et SEQ ID NO 8 (correspondant à l'isoforme 4), ces isoformes 1 à 4 ètant respectivement codées par les séquences nucléotidiques représentèes par SEQ ID NO 1 , SEQ ID NO 3. SEQ ID NO 5 et SEQ ID NO 7, ou codèes par toutes sèquences nucléotidiques dérivées de ces dernières, notamment par dègènèrescence du code génétique.
L'invention vise plus particulièrement les anticorps tels que dècrits ci- dessus, dirigés contre l'une au moins des isoformes 3 et 4 de l'α1 ,3GT présentes chez le porc et représentées par les séquences en acides aminés SEQ ID NO 6 et SEQ ID NO 8.
Avantageusement les anticorps anti-α1 ,3GT susmentionnés de l'invention sont des anticorps simple brin dont les séquences en acides aminés sont telles qu'elles contiennent les parties CDRl , CDR2 et CDR3 de la chaîne lourde desdits anticorps anti-α1,3GT reliés par une séquence liante (linker) d'environ 6 à environ 36 acides aminés, à tout ou partie de la chaîne légère Vλ3 des anticorps anti-α1 ,3GT susmentionnés.
Un linker particulièrement préféré est celui constitué de trois répétitions successives de la séquence en acides suivante :
Gly - Gly- Gly- Gly- Ser
Des anticorps particuliers selon l'invention sont ceux représentés par les séquences en acides aminés SEQ ID NO 10 (anticorps désigné ScFv1), SEQ ID NO 12 (anticorps désigné ScFv2), SEQ ID NO 14 (anticorps désigné ScFv3), SEQ ID NO 16 (anticorps désigné ScFv4) et SEQ ID NO 18 (anticorps désigné

ScFv5), ou par toute séquence en acides aminés dérivée de ces dernières, notamment par addition, suppression ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés, ou par tout fragment des séquences susmentionnées ou de leurs séquences dérivées, lesdites séquences dérivées et lesdits fragments étant susceptibles de reconnaître l'une au moins des isoformes de l'α1 ,3GT.
L'invention a également pour objet les séquences nucléotidiques codant pour un anticorps anti-α1,3GT tel que décrit ci-dessus, et comportant notamment les séquences nucléotidiques représentées par SEQ ID NO 9 (codant pour ScFv1), SEQ ID NO 11 (codant pour ScFv2), SEQ ID NO 13 (codant pour ScFv3), SEQ ID NO 15 (codant pour ScFv4), SEQ ID NO 17 (codant pour

ScFv5), ou toute séquence nucléotidique dérivée de ces dernières, notamment les séquences dérivées par dégénérescence du code génétique, et étant néanmoins capables de coder pour les anticorps ScFv1 , ScFv2, ScFv3. ScFv4 ou ScFv5, ou les séquences dérivées par addition, suppression ou substitution d'un ou plusieurs nucléotides, ou tout fragment des séquences nucléotidiques susmentionnées ou de leurs séquences dérivées, lesdites séquences dérivées et lesdits fragments étant susceptibles de coder pour un anticorps susceptible de reconnaître l'une au moins des isoformes de l'α1 ,3GT.
Les séquences nucléotidiques SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 11 , SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 15 et SEQ ID NO 17 susmentionnées sont avantageusement obtenues par séquençage des ADNc codant pour les anticorps représentés par SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 16 et SEQ ID NO 18 respectivement, ces ADNc provenant de clones cellulaires sélectionnés pour leur capacité à produire lesdits anticorps, la sélection desdits clones cellulaires étant effectuée à l'aide de l'isoforme 2 de l'α1 ,3 GT (à savoir du polypeptide représenté par SEQ ID NO 4) utilisée en tant que molécule cible leconnue par lesdits anticorps, lesdits clones cellulaires, étant eux-mêmes obtenus par transformation de cellules, notamment de bactéries ou de phages. avec des séquences nucléotidiques provenant d'une banque d'ADNc codant pour des anticorps, telle que la banque susmentionnée décrite par Nissim et al., 1994, ou piovenant d'hybridomes obtenus selon la technique indiquèe ci-dessus par immunisation d'un animal avec ladite isoforme n° 2 de l'α1 ,3GT.
L'invention a également pour objet tout vecteur, notamment plasmide, contenant l'une au moins des séquences nucléotidiques dècrites ci-dessus selon l'invention, notamment l'une au moins des séquences SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 11 , SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 15 ou SEQ ID NO 17, et les élèments nècessaires à l'expression des anticorps anti-molécules, et plus particulièrement des anticorps anti-α1 ,3GT susmentionnés.
L'invention concerne également tout hôte cellulaire (telle qu'une cellule eucaryote) contenant l'un au moins des vecteurs tels que décrits ci-dessus, selon l'invention.
L'invention concerne également tout mammifère transgénique non humain, ou toute cellule de mammifère transgénique non humain, comprenant dans leur génome au moins une séquence nucléotidique dècrite ci-dessus, codant pour des anticorps anti-molécules tels que décrits ci-dessus, et plus particulièrement pour des anticorps anti-α1 ,3GT susmentionnès.
L'invention a plus particulièrement pour objet tout mammifère transgénique non humain, ou toute cellule de mammifère transgénique non humain, tels que décrits ci-dessus, comprenant dans leur génome au moins une des séquences nucléotidiques représentées par SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 15 et SEQ ID NO 17, ou au moins une sèquence dérivée ou fragment tels que définis ci-dessus, desdites sèquences nucléotidiques.
Avantageusement, les mammifères transgéniques non humains, selon l'invention sont tels qu'obtenus par introduction, notamment par microin)ection, dans un ovocyte fécondé, d'au moins une sèquence nuclèotidique telle que dèfinie ci-dessus, codant pour un anticorps anti-molécules tel que défini ci- dessus, et plus particulièrement d'au moins une des séquences nucléotidiques teprésentées par SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 11 , SEQ ID NO 13, SEQ NO 15 et SEQ ID NO 17, ou leur séquence dérivée ou fragment tels que dèfinis ci-dessus, et insertion de l'embryon dans la matrice d'une mère de substitution et dèveloppement de l'embryon à terme.
L'invention a également pour objet tout mammifère transgènique non humain défini ci-dessus, tel que produit par croisement d'animaux transgéniques exprimant au moins une sèquence nucléotidique telle que définie ci-dessus, codant pour un anticorps anti-molécules, et plus particulièrement au moins une des sèquences nuclèotidiques représentèes par SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 11 , SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 15 et SEQ ID NO 17, ou leur séquence dèrivèe ou tiagment tels que définis ci-dessus.
A titre d'illustration, les mammifères transgéniques non humains, selon l'invention, peuvent être obtenus selon la méthode décrite dans l'article de DePamphihs M .L., et al ., 1988.
Parmi les mammifères transgéniques non humains susceptibles d'être obtenus dans le cadre de la présente invention, on peut citer la souris, le rat, le porc ou le lapin.
L'invention a plus particulièrement pour objet les porcs transgèniques contenant dans leur génome au moins une des séquences nucléotidiques reprèsentées par SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 11 , SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 15 et SEQ ID NO 17, ou leur séquence dérivée ou fragment tels que définis ci-dessus.
L'invention concerne également les cellules cultivées à partir des animaux transgèniques non humains tels que décrits ci-dessus.
L'invention a également pour objet les organes de mammifères non humains, et plus particulièrement les organes de porc, notamment les rems, le foie, le pancréas ou le coeur, comprenant dans le génome des cellules les constituant au moins une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus, codant pour un anticorps anti-molécules, et plus particulièrement d'au moins une des sèquences nucléotidiques représentées par SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 11 , SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 15 et SEQ ID NO 17, ou leur séquence dérivée ou fragment tels que définis ci-dessus, lesdits organes étant tels qu'obtenus par prélèvement sur des mammifères transgéniques non humains selon l'invention.

L'invention concerne également tout polypeptide comprenant la séquence d'acides aminés telle que représentée par SEQ ID NO 6 (correspondant a l'isoforme 3 de l'α1 ,3GT) ou SEQ ID NO 8 (correspondant à l'isoforme 4 de l 'α1,3GT), ou tout polypeptide contenant tout fragment d'au moins environ 6 acides aminés, de l'une des susdites séquences d'acides aminès, ledit polypeptide contenant ce fragment étant susceptible de générer des anticorps reconnaissant l'une au moins des quatre isoformes de l'α1 ,3GT, ou comprenant toute séquence dérivée de ces dernières, notamment par addition, suppression ou modification d'un ou plusieurs acides aminés, sous réserve que la séquence dérivèe soit susceptible de générer des anticorps reconnaissant l'une au moins des quatre susdites isoformes.
L'invention a également pour objet les séquences nucléotidiques comprenant les séquences représentées par SEQ ID NO 5 et SEQ ID NO 7, ou toutes séquences dérivées, notamment les séquences dérivées par dégénérescence du code génétique, et étant néanmoins capables de codci pour les polypeptides représentés par les séquences en acides aminès représentées par SEQ ID NO 6 et SEQ ID NO 8 respectivement, ou les séquences dérivées par addition, suppression ou substitution d'un ou plusieurs nucléotides, ou tout fragment des séquences nucléotidiques susmentionnées ou de leur séquences dérivèes, lesdites séquences dérivées et lesdits fragments étant susceptibles de coder pour un anticorps susceptible de reconnaître l'une au moins des isoformes de l'α1 ,3GT.

L'invention concerne également tout vecteur, notamment plasmide, comprenant au moins une séquence nucléotidique codant pour les séquences reprèsentées par SEQ ID NO 5 ou SEQ ID NO 6, ou par une séquence dérivèe ou fragment ce ces dernières, tels que définis ci-dessus, ainsi que les éléments nécessaires à l'expression des isoformes de l'α1 ,3GT codées par lesdites séquences nucléotidiques.
L'invention vise également tout hôte cellulaire transformé par un vecteur tel que décrit ci-dessus, ainsi que tout procédé de préparation des isoformes 3 et 4 susmentionnées de l'α1,3GT par mise en culture dudit hôte cellulaire dans un milieu de culture approprié, et séparation desdites isoformes des autres constituants du milieu de culture.
L'invention a plus particulièrement pour objet toutes séquences nuclèotidiques avantageusement obtenues par séquençage des ADNc codant pour les anticorps dirigés contre les isoformes 3 et 4 susmentionnées de l'α1.3GT, ces ADNc provenant de clones cellulaires sélectionnés pour leur capacité a produire lesdits anticorps, la sélection desdits clones cellulaires étant effectuèe a l'aide de l'isoforme 3 et/ou 4 de l'α1 ,3 GT (à savon des polypeptides lepresentés par SEQ ID NO 6 et SEQ ID NO 8, respectivement) utilisées en tant que molécules cibles reconnues par lesdits anticorps, lesdits clones cellulaires, étant eux-mêmes obtenus par transformation de cellules, notamment de bactéries ou de pliages, avec des sèquences nucléotidiques provenant d'une banque d'ADNc codant pour des anticorps, telle que la banque susmentionnée décrite par Nissim et al., 1994, ou provenant d'hybridomes obtenus selon la technique indiquèe ci-dessus par immunisation d'un animal avec ladite isoforme 3 ou ladite isoforme 4 de l'α1 ,3GT.
L'invention a ègalement pour objet toute méthode, notamment chirurgicale, de traitement de patients nécessitant une greffe de cellules ou d'organes, par implantation desdites cellules transgéniques selon l'invention dans des tissus appropriés dudit patient, ou par suppression de l'organe dèfectueux du patient et remplacement de cet organe défectueux par un organe de mammifère non humain transgénique selon l'invention.
L'invention sera davantage illustrèe à l'aide de la descnption dètaillèe qui suit de l 'obtention des différentes isoformes de l'α1 ,3GT de porc, ainsi que de la tiansformation de cellules animales à l'aide de sèquences nuclèotidiques codant pour des anticorps anti-α1 ,3GT selon l'invention, et de procédures d'obtention d'animaux transgéniques selon l'invention.

Obtention des différents isoformes de l'α1 ,3 GT

1) Procédures expérimentales

a) Cellules et tissus
Les organes poicins ont été obtenus à partir de porcs d'environ 200 a 300 kg L'isolement enzymatique et la culture des cellules endothéhales aortiques de porc (PAEC) ont été réalisés selon la méthode décrite dans l'article de Warren, 1990. Les PAEC sont stimulées avec 100 U/ml de TNFα humain (Genzyme,

Cambridge, USA) en présence ou non de10 μg/ml de cycloheximide.

b) Oligonucléotides
Les oligonucléotides suivants ont été utilisés :
- oligonucléotide 1
5'-AGGAAGAGTGGTTCTGTC-3' hybridant aux nucleotides 24 à 41 de la sèquence SEQ ID NO 1 ,
-oligonucléotide 2
5'-GTTATGGTCACGACCTCT-3' hybridant aux nucleotides 323 a 306 de la séquence SEQ ID NO 1 ,
-oligonucléotide 3
5'-TATAGAATTCGAAAATAATGAATGTCAAAGGAATAGTGGTTCTGTC -3' hybridant à un site EcoRI situé en amont des nucleotides 1 à 41 de la séquence SEQ ID NO 1 ,
- oligonucléotide 4
5'-ATATAACTAGTGGAAGCTCTCCTCTGTTG-3' hybridant aux nucleotides 278 à 255 de la séquence SEQ ID NO 1 , et introduisant une mutation de G en A dans la troisième base du codon codant pour une proline,
- oligonucléotide 5
5'-ATATACTAGTGGACTGGTTTAATC-3' hybridant aux nucleotides 275 à 292 de la séquence SEQ ID NO 1 , et introduisant la même mutation de G261 en A comme dans le cas de l 'oligonucléotide 4,

- oligonucléotide 6
5'-GAGTCACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAATCGATGTTATTTCTAACCA AATT-3' hybridant aux nucleotides 1105 à 1123 de la séquence SEQ ID NO 1 , et additionné en phase à un oligonucléotide codant pour un peptide FLAG (Kodak, New Haven, USA) un codon stop et un site XhoI.

c) clonage et construction
Un clone d'ADNc α1,3GT de 2 Kb (pCDNA-αGT) a été isolé d'une banque d'ADNc construite dans le vecteur pCDNA-1 (Invitrogen, Leek, Pays-Bas) par hybridation de transfert en utilisant une sonde PCR amplifiée avec les amorces 1 et 2 (dérivées de la séquence publiée dans l'article de Sandrin et al., 1994. Ce clone correspond à celui de l'isoforme n° 2.
Les isoformes 1, 3 et 4 de l'α1 ,3GT porcine ont été isolées par amplification par PCR d'une région comprenant les exons 4 à 7 avec les amorces 1 et 2, en utilisant TARN rétro-transcript des PAEC. Les fragments amplifiés sont traités par la polymérase de Klenow, pour obtenir des extrémités franches, et clones dans le site SmaI du plasmide pUC18. Trois clones contenant des fragments de 300, 237 et 201 pb ont été obtenus et utilisés en tant que matrice pour introduire, par amplification PCR secondaire, un site EcoRI à l 'extrémité 5' (avec l'oligo 3) et un site SpeI dans l'exon 7 (avec l'oligo 4). L'introduction de ce site SpeI ne modifie pas la séquence en acides aminés. Les produits de PCR ont été ligués dans un plasmide pKS digéré par EcoRI-SpeI. La partie 3' restante de la séquence codante a été amplifiée par PCR à partir du clone pCDNA-αGT avec les amorces 5 et 6, traitée pour obtenir des extrémités franches et clonée dans le site EcoRV d'un plasmide pKS. A partir de ce plasmide recombinant, un fragment SpeI portant la région codante du nucléotide 262 à 1125, en phase avec une séquence FLAG (contenue dans l 'oligonucléotide 6). a été isolée et clonée dans les sites SpeI des plasmides pKS contenant les régions 5' variables. Les construits résultant ont été contrôlés par séquençage, et les fragments EcoRI, contenant les séquences codantes entières ont été sousclonés dans le vecteur d'expression encaryotique pCDAAS-néo conduisant l'expression du transgène sous contrôle du promoteur du CMV. L'isoforme 2 de l 'αGT porcine a été isolée de la même manière, en utilisant le clone pcDNA-α GT comme matrice initiale.

d) transfection de cellules
Des cellules HeLa cultivées en RPMI - 10 % FCS ont été traitées par la trypsine, resuspendues à raison de 5.106 cellules/ml dans un milieu glacé et mélangées avec 20 μg/ml d'ADN plasmidique portant le transgène et un gène de résistance à la néomycine. Les cellules ont été traitées par électroporation à 250 V, 350 μF, laissées dans la glace pendant 10 mn et ensemencées à raison de 2000 cellules/cm2. Après 24 h, 500 μg/ml G418 ont été additionnés et les cellules ont été cultivées pendant deux semaines. Les clones ont été isolés et cultivés en présence de G418.

e) immunofluorescence
Les clones de cellules HeLa exprimant une des quatre isoformes de l 'a 1 ,3GT ont été ensemencées sur des lamelles à 4 chambres pour microscope

(Nunc, Rookilde, Danemark), pour l'analyse de l'expression des épitopes α-galactosyl sur les membranes cellulaires. Deux jours après l'ensemencement, les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS, fixées pendant 10 mn à température ambiante avec du paraformaldéhyde 3 % , lavées encore et incubées pendant une heure à température ambiante avec l'isolectine B4 - FITC de

Banderaea simplicifolia (Sigma, St Louis, USA), dilution au 1.100 dans du

PBS. Les lamelles ont été lavées 4 fois dans du PBS avant montage. Pour la localisation subcellulaire, les cellules ont été fixées avec du paraformaldéhyde 3 % et perméabilisées par trois incubations séquentielles de 5 mn avec 50 % , 100 % et 50 % d'acétone glacée. Après trois lavages avec du PBS/Tween-20 0,5 % , les cellules ont été incubées avec l'anticorps anti-FLAG M2 (1 :200 ; Kodak,

New Haven, USA), puis incubées pendant une heure avec un anticorps secondaire d'âne anti-souris marqué au FITC (1 : 500 ; Jackson, Baltimore, USA). Les préparations ont été montées dans un fluide FA (Difco, Grayson, USA) et visualisées avec un microscope à epifluorescence Nikon.

f) Analyses par transfert d'ADN (Northern blot)
L'ARN cellulaire total a été isolé à partir de cellules cultivèes et d'organes décrits par Zipfel et al.., 1989. Dix μg d'ARN total ont étè fractionnes sur un gel d'agarose/formaldéhyde, transférés sur une membrane Hybond N (Amersham, Little Chalfont, UK) par action capillaire dans 20 X SSC pendant 16 h et immobilisés par réticulation aux UV. Les filtres ont étè pre-hybridés pendant 6 h dans une solution contenant 50 % de formamide, 5 X SSPE (0, 18 M NaCl, 10 mM phosphate de sodium, pH7,7, 1 mM EDTA), 5 X Denhart's, 0.5 % SDS, et 100 μg/ml d'ADN dénaturé de sperme de saumon. L'ARN lié aux membranes a été hybride avec des sondes d'ADNc marquèes au p32 correspondant à la région codante de l'isoforme 1 de l'α1 ,3 GT, à la β-actine poicine ou à l'ARN 28S. L'hybridation a été réalisée pendant une nuit a 42°C dans une solution de pré-hybridation contenant 106 cpm/ml d'une sonde. Les filtres ont èté lavés deux fois dans 2 X SSPE, 0,5 % de SDS à tempèrature ambiante pendant 15 mn, et trois fois dans 0,5 X SSPE, 0,5 % SDS a 65 °C pendant 15 mn. L'hybridation a été visualisée et les signaux quantifiés avec un dispositif phosphorimage (Molecular Dynamics, Sunnyvale, USA).

g) test de protection à la RNase
Les tests de protection à la RNase ont été réalisés selon la méthode dècrite par Melton et al., 1984 Deux sondes d'ARN, complémentaires des exons 5 et

6, et des exons 4 et 7, ont été préparées de la manière suivante deux fragments EcoRI-SpeI, correspondant aux nucleotides 7 à 266 du clone αG Tiso 1 , et aux nucleotides - 7 à 174 du clone αGT iso4 (Fig. 1) ont été sous clones dans les sites EcoRI-SpeI des plasmides pKS. En utilisant l'ARN polymerase T7, les sondes d'ARN antisens ont été synthétisées et du 32p dUTP a été încorpoié. L'ADN plasmidique matrice a été digéré avec l'ADNase I, et 500 000 cpm de chaque sonde ont èté hybrides pendant 16 h à 10 μg d'ARN total d'oiganes porcins ou de cellules dans 30 μl de tampon d'hybridation contenant 80 % de formamide, a 50 °C. Les échantillons de contrôle contiennent 10 μg d'ARN de levure Les mélanges d'hybridation été dilués a 400 μl avant l'addition de 5 μg/ml de RNase A et 10 U/ml de RNase T1. Après 1 h à 30 °C, 50 %g de protéinase K et de SDS à 0,5 % ont été ajoutés. Le mélange a ensuite été extrait au phenol/chloroforme et précipité a l'éthanol. Les produits de digestion ont été analysés sur des gels de polyacrylamide à 6 % . Les gels ont été exposes pendant 16 h contre des films Kodak AR a - 80°C.

2) Rèsultats

a) Clonage de quatre isoformes de l'α1,3GT
Comme décrit piecedemment, une banque d'expression d'ADNc porcin construite en utilisant l'ARN LLC-PK1 (Guerif et al, 1995), a été criblée en utilisant une sonde correspondant à l'extrémité 5' de la séquence codante. Un clone d'ADNc, pcDNA-αGT, avec la région codante correspondant à une α1 ,3GT porcine dèjà dècrite (Sandrin et al, 1994), a èté isolé Cette α1 ,3 GT correspond a l'isoforme 2 représentée par SEQ ID NO 4 et codèe par la sèquence SEQ ID NO 3 Ce clone pcDNA-αGT contient une règion 3 ' non traduite longue de 770 pb, une région codante de 1080 pb contenant les homologues porcins de ce qui a été défini dans le cas de la souris comme étant les exons.. 4, et 6 à 9 (Joziasse et al., 1992) et une région 5' non traduite de 150 pb. En utilisant des amorces adjacentes aux exons 4 et 7, l'amplification PCR de l'ADN des PAEC a été réalisée. Des produits d'amplification d'environ 200 pb a 300 pb ont été trouvés, suggérant l'existence de transcrits supplèmentaires. Trois produits différents ont èté clones, l'un deux étant identique a la sèquence dècrite par Strahan et al, 1995 (et designée ici comme ètant l'isoforme 1 , Fig 1 , à savoir l'isoforme reprèsentée par SEQ ID NO 2 codèe par la séquence SEQ ID NO 1) . En comparaison avec l'isoforme 2 susmentionnée (provenant du clone pcDNA-αGT), il contient un segment supplèmentaire de 36 pb après le nucléotide 80. Un autre produit, l'isoforme 3 , a savoir l'isoforme représentèe par SEQ ID NO6 codée par la sèquence SEQ ID NO5, ne comporte pas un segment de 63 pb du nucléotide 117 au nucléotide 179 et le dernier produit, l'isoforme 4, à savoir l'isoforme représentèe par SEQ ID NO 8, et codée par la séquence SEQ ID NO7, ne comporte pas le segment de 36 pb du nucléotide 81 au nucléotide 116, et le segment de 63 pb du nuclèotide 117 au nuclèotide 179 (Fig. 1). La traduction des ARNm correspondant a chacun des transcripts identifiés, prédit la synthèse de quatre tonnes du polypeptide α1,3GT, de 372, 360, 351 et 339 acides aminès qui different seulement dans la longueur de leurs régions "stem" (tiges) respectives.

La situation dècrite ici est comparable à celle décrite dans le cas de la souris (Joziasse et al., 1992), puisque quatre ARNm différents ont été trouvés, contenant les exons 5 et 6, ou contenant seulement l'exon 5 ou l'exon 6, ou ne contenant ni l'exon 5 ni l'exon 6. Les segments porcins de 36 pb et 63 pb correspondent bien aux exons 5 et 6 murins, à l'exception du fait que, dans la souris, l 'exon 6 est long de 66 pb au lieu de 63 pb chez le porc (Fig. 1).

b) Activité α1 ,3GT des isoformes
La présence ou l'absence des exons 5 et 6 détermine quatre variations de longueur dans la région stem de l'α1,3GT. Cette région, localisée à l'intérieur de l'appareil de Golgi, lie le signal d'ancrage transmembranaire au domaine luminal catalytiquement actif. Afin de vérifier si les quatre isoformes définies par l'épissage alternatif des exons 5 et 6 sont catalytiquement actifs, des cellules HeLa humaines ont été transformées avec des plasmides recombinants exprimant chacune des quatre isoformes de l'α1,3GT porcine sous le contrôle du promoteur CMV. Le produit de cette enzyme sur les surfaces des cellules a été analysé par immuno fluorescence, en utilisant la lectine IB-4 réagissant spécifiquement avec les résidus Galα. L'épitope Gala pouvait être détecté à la surface des cellules HeLa traduites avec les quatre isoformes de l'enzyme, comme le montre la liaison à la lectine IB-4 (Fig. 2), indiquant que ces isoenzymes possèdent toutes une activité α-galactosyltransférase. Les niveaux d'expression des ARNm de l'α1 ,3GT dans les clones IIeLa-α1,3GT de porc, ont été contrôlés par Northern blot, et sont légèrement supérieurs dans les clones contenant les isoformes 1 et 2, et légèrement inférieurs pour le clone contenant les isoformes 2 et 3, par rapport au niveau trouvé dans les PAEC.

c) Localisation subcellulaire des isoformes α1 ,3GT
La localisation Golgienne de l'α1 ,3GT est due à la présence dans l'exon 4 d'un domaine signal d'ancrage. Les variations de longueur dans la région stem, c'est-à-dire la présence ou l'absence des exons 5 et 6, peuvent également influencer la rétention dans le Golgi (Dahdal et al., 1993) ou exposent un site de clivage sensible aux protéases sur certaines isoformes (Weinstein et al., 1987 ;

Lammers and Jamieson, 1989, Shaper et al., 1986 ; Yadav and Brew, 1991). Afin de vérifier si ces variations de la région stem de l'α1 ,3GT pourraient modifier la localisation dans le Golgi, la localisation cellulaire des différentes isoformes a été analysée. Les quatre vecteurs d'expression basés sur le CMV décrits ci-dessus, expriment les isoformes α1,3 GT avec un marqueur FLAG fusionné à l'extrémité C-terminale ce qui permet de détecter la protéine par immunofluorescence indirecte dans les cellules HeLa transfectées avec un anticorps anti-FLAG. Comme observé par microscopie a fluorescence, les quatie isoformes sont localisèes de façon similaire et forment une structure luxtanucléaire compacte coi respondant à celle de l'appareil de Golgi (Roth et Berger, 1982). De façon surprenante, alors que 100 % des cellules expriment l'enzyme, comme cela a été mis en èvidence par coloration uniforme obtenue avec la lectine IB4, l'enzyme n'est pas détectable sur la totalité de ces cellules en utilisant l'anticorps anti-FLAG. Cela peut être due a une expression irrègulière de l'enzyme associée à une sensibilité limitèe de l'anticorps, ou a la reorganisation de l'appareil de Golgi durant le cycle cellulaire.

d) Expression des isoformes de l'α1,3GT
L'epitope Galα1 ,3Gal, résultant de l'activité de l'α1 ,3GT, n'est pas exprime de façon homogène dans les tissus de porc (Oriol et al., 1993). Dans le but d'ètudier ces variations au niveau enzymatique, le niveau des transcripts α 1 ,3GT a étè ètudié par Northern blot, et la distribution des isoformes a été ètudièe par test de protection à la RNase.
L'analyse par Northern blot montre l'expression dans tous les tissus ètudiés, mais avec une différence frappante entre les tissus. Les reins contiennent environ 50 % de ce que l'on trouve dans la rate, le thymus 40 % et le coeur et les ovaires, 20 à 25 %. Les poumons et le foie contiennent moins de

10 % de ce qui a été trouvé dans la rate. La stimulation des cellules endothéhales avec les cytokines inflammatoires induit une augmentation de la règulation ou la synthèse de beaucoup de gènes, dont les molécules d'adhésion, à savon les molècules liées à l'inflammation et la coagulation. Une augmentation de la règulation de l'α1 ,3GT n'a jamais été décrite dans les cellules endothéhales. En utilisant des PAEC stimulées pendant 6 heures avec 100 U/ml de TNFα humain, une augmentation de deux fois le niveau global d'ARNm codant pour l'α1,3GT a été observée. L'incubation des PAEC en prèsence de cycloheximide augmente également le niveau d'ARNm codant pour l'α1 ,3GT probablement par stabilisation du messager. De façon surprenante, la stimulation par TNFα + cycloheximide ne conduit pas a une augmentation du niveau de l 'ARNm codant pour l'α1,3GT, mais plutôt à une légère diminution.. Cet effet est peut-être relie à la découverte du fait que la cycloheximide facilite l'apoptose due au TNFα conduisant à une diminution de la règulation de certains antigènes (Malorni et al., 1993).
L'expression des isoformes de l'α1 ,3GT a été analysèe par test de protection a l'ARNase dans les tissus de porc. Deux sondes antisens radiomarquées ont été utilisées pour analyser les quatre espèces d'ARN identifiées.
Le transcript de l'ARNm de l'isoforme 1 hybride avec un fragment de 273 pb sur la sonde 1 correspondant à une séquence délimitée par les nucleotides 7 à 266 sur le transcript (les numéros des nucleotides correspondent à la séquence représentée sur la figure 1 , isoforme 1). L'hybridation de la sonde 1 avec l'ARNm codant pour l'isoforme 2 conduit à un fragment de 87 pb délimité par les nucleotides - 7 à 80, et un fragment plus grand de 150 pb délimité par les nucleotides 117 à 266. L'hybridation de la sonde 1 avec l'ARNm codant pour l'isoforme 3 conduit à un fragment de 123 pb délimité par les nucleotides - 7 à 116 et un plus petit fragment de 87 pb délimité par les nucleotides 180 à 266. L'hybridation de la sonde 1 avec l'ARNm de l'isoforme 4 de l'a 1 ,3 GT conduit à deux fragments de 87 pb délimités par les nucleotides - 7 à 80 et par les nucleotides 180 à 266. La deuxième sonde, sonde 4, est un fragment d'ARNm de 174 pb correspondant à l'isoforme 4. Il est entièrement protégé par l'ARNm codant pour l'isoforme 4, et conduit à deux fragments de 87 pb avec les isoformes 1 , 2 et 3.
Les fragments de sonde protégés par les ARNm codant pour les isoformes 1 , 2 et 3 sont ceux de 273, 150 et 123 pb, respectivement, la sonde 4 protégée par l'ARNm codant pour l'isoforme 4 conduit à une bande de 174 pb. La répartition des produits de transcription diffère d'un tissu à un autre : dans le rein, l'isoforme 3 seule est exprimée, alors que dans les ovaires, seule l'isoforme 4 est exprimée. Dans le coeur, les poumons et la rate, on trouve les isoformes 1 et 2, alors que les isoformes 2 et 4 sont trouvées dans le foie. Les cellules endothéliales expriment les isoformes 1 , 2 et 4. Dans les thymus, on peut observer les 4 isoformes.

II - Transformation de cellules animales à l'aide de séquences nucléotidiques codant pour des anticorps anti-α1,3 GT selon l'invention

1 ) Matériels et méthodes

a) Banques d'ADNc, cellules et plasmides :
La banque d'ADNc provient de cellules épithéliales porcines LLC-PK1. Elle est construite dans le vecteur pCDNA-1. Les souches bactériennes utilisées sont E coli-TG1 sup E, E. coli-XL-1 , SURE, M15, MC 1061/P3, et DH5α. Le plasmide d'expression procaryote pQE-30 vient de Qiagen. Le plasmide d'expiession eucaryote pCDAAS-9, contient un gène de rèsistance a la neomycine et entraîne la transcription d'ADNc qu'il porte sous le contrôle du promoteur du cytomegalovirus. La banque d'immunoglobulines humaines ScFv est construite dans le plasmide pHEN-1 et a été utilisèe comme dècrit dans I 'article de Nissim et al., 1994. La préparation des pliages recombinants est ègalement dècrite

b) Système d'expression recombinante et purification :
Le système de production et de purification de l'α1,3GT recombinante provient de Qiagen. La transcription a étè induite par culture des E. coli-M15 transformèes par l'ADNc de l'enzyme avec 2mM IPTG, pour 5 heures. La protèine recombinante dans le lysat cellulaire a été alois purifièe sur une colonne echangeuse d'ions, en conditions dénaturantes. La protèine purifièe a été dialysee en PBS et stockèe a -20°C jusqu'à son utilisation.

c) ΕLISA
Des plaques de microtitration (Nunc) ont été glacées une nuit a 4°C avec

5 μ/ml de protéine α1 ,3GT purifiée, en tampon carbonate a pH 9,5. Elles ont ensuite été saturèes 2h a 37 °C en 2% lait ecreme, puis incubèes 2h, 37°C avec une suspension de phages recombinants exprimant un fragment ScFv d'anticorps provenant de la banque ScFv Après lavage, les plaques ont été incubèes 1h, 37°C avec un anticorps anti-phage M13 marqué a la peroxydase (Pharmacia), dilue 1/500 La révélation a été effectuée par réaction de la peroxydase avec de la diaminobenzidine en prèsence d'eau oxygènèe.

d) Transfection et cellules porcines :
Des cellules de porc LLC-PK1 ont été transfectees avec des plasmides pCDAAS portant l'ADNc de clones anti-α1 ,3 GT positifs. La transfection a été lealisee par electroporation d'un mélange de 500.000 cellules et de 20 μg d'ADN plasmidique, a 250V et 350μF. Les clones ont été sèlectionnes par culture de 15 jours en prèsence de 1500 μ/ml de neomycine (G418) isoles a l 'aide d'anneaux de clonage et cultivés séparément en prèsence de G418 jusqu'à l'analyse .

e) Immunofluorescence et cytofluorométrie :
Les cellules ont été marquées par l'isolectine B4 de Bandeiraea sunplicifoha marquée à la fluorescéine (IB-4-FITC, Sigma), lectine spècifique des structures α-galactose. les cellules ont été lavées à 4°C en PBS-2%BSA, incubées à 4°C pendant 30 mn. avec 20 μg/ml IB-4-FITC, relavees 3 fois et analysées par cytofluorométrie en utilisant un FACS-can (Becton Dickinson).

f) Sèquence :
Les reactions de sèquence ont été effectuées avec la D-taq (Amersham), en utilisant comme amorces deux oligonucléotides situes dans la partie 5 ' du segment Vλ3. Oligo 1 , permettant la lecture de la partie 5 ' de l'ADNc 5 '- TTCTGAGGCTGTCTCCTT-3'. Oligo 2, permettant la lecture de la partie 3 ' de l'ADNc 5'-ATCGTCTGAGCTGACTCA-3'.

g) Ciblage moléculaire des ScFv anti-α1 ,3-GT dans le Golgi :
Dans le but de faire exprimer les anticorps ScFv dans le même compartiment cellulaire que l'α1 ,3 GT, c'est-à-dire dans le Golgi, des séquences signal et de rétention golgienne ont été ajoutées aux clones ScFv, en N-terminal et en C-terminal, respectivement. Les séquences signal et de létention choisies ont été adaptées à partir des données rapportées par

Richardson et al., 1995. Elles ont été introduites par amplification PCR des clones ScFv de départ, a l'aide d'amorces contenant l'ADNc de ces sèquences, et des sites de restriction pour le clonage. La séquence de ces amorces est la suivante :
- amorce encodant la séquence signal :
5'-TTTGAATTCATGGAAAGGCACTGGATCTTTCTCTTCCAGGT GCAGCTGGTGCAG-3'.
- amorce encodant la séquence de rétention golgienne
5'-TTTCTCGAGTTATTACAGCTCGTCCTTTTCGCTACCTAGGA
CGGTGCAGCTT-3' .

2) RESULTATS

a) Clonage de l'α1 ,3GT de porc
Un fragment de 313bp correspondant à l'extrémité 5' de l'ADNc de l'α

1 ,3GT de porc a étè amplifié par RT-PCR à partir d'ARN de cellules endothéhales aortiques de porc. Ce fragment a servi de sonde pour le clonage de l'ADNc entier dans une banque de cellules épithéhales de porc exprimèe en E. Coli MC1061 P3, dans le plasmide pCDNA-1. Le clone isolé mesure environ 2Kb. comporte une partie 5' non codante de 147 pb suivie d'une phase ouverte de lecture de 1104 pb et d'une partie 3' non codante d'environ 750 pb. II correspond a l'isoforme de l'enzyme dont l'exon 5 est absent (a savoir l 'isoforme 2 représentée par SEQ ID NO 4). L'ADNc poicin isolé est fonctionnel car il confère une activité α1 ,3GT à des cellules Cos, naturellement dèpourvues de cette activité, après transfection. Cette activitè peut être dèmontrée par l'acquisition d'une réactivité avec l'isolectine B4 de Bandeiraea simplicifoha, marquant spécifiquement les résidus α-galactosylés.

b) Expression protéique de l'α1 ,3GT recombinante.
La partie codante de l'α1 ,3GT a été sous-clonée par PCR dans le vecteur d'expression procaryote pQE30 (Quiagen), en fusion en 5' avec une queue de six histidines servant à la purification de la protéine recombinante sur une matrice chargée (Ni-NTA). Le clone ainsi obtenu a étè entièrement séquence pour s'assurer de l'absence de mutations par rapport au clone de départ, qui auraient pu être introduites lors de l'amplification PCR. Le plasmide pQE30-α 1 ,3GT a été introduit dans E. Coli M15 et la protéine recombinante produite in vitro par induction de la transcription à l'IPTG, et purifiée.
c) Production d'anticorps ScFv anti-α1 ,3GT
La banque d'immunoglobulines (Ig) humaines est constituée par 50 séquences de parties variables de chaînes lourdes d'Ig en configuration germinale, associées à un peptide contenant de 4 à 12 acides aminés aléatoires, codant par la partie CDR3 de la chaîne lourde, et insérées dans le phagemide pHEN1-Vλ3, en fusion avec la partie plasmidique codant pour la protéine g3p de l'enveloppe phagique. Les phages pouvant être dérivés de ces plasmides expriment donc un fragment (ScFv) d'Ig fonctionnel en fusion avec une protèine d'enveloppe, et se comportent, au niveau de leur propriétès de reconnaissance d'un antigène, comme I'Ig dont ils expriment la sèquence. Les phages dérivés de cette banque d'Ig ont fait l'objet de 4 tris successifs par "panning" sur la protèine recombinante purifiée, comme décrit dans Nissim et al., 1994

d) Test ELISA de la positivité des anticorps ScFv anti-α1 ,3GT.
Quatre-vingt-seize colonies individuelles de bacténes E. Coli-TG1 supE contenant chacune un clone pHEN1-ScFv ont été isolées, de manière alèatoire, apies les 4 cycles d'enrichissement à rencontre de la protéine α1 ,3GT. Ces colonies ont été cultivées une nuit dans 200μl de milieu LB, en plaque de microtitration. Le surnageant, contenant des phages exposant sur leur enveloppe 1 a 3 molècules de fragment ScFv d'anticorps, a étè testé par ELISA pour mesurer la reactivite relative des différents clones à rencontre de l'α1 ,3GT. Sur les 96 clones testés, 15 montraient une réactivité supérieure a tiois fois le niveau du contiôle (Figure 2). Les six clones les plus positifs ont été réamplifiés et des phages purifies ont été prépares à partir de 500 ml de surnageant de bactèries TG-1. Les phage purifiés, et concentrés par précipitation et resuspension en PBS ont un titre supérieur à 1010 cfu/ml. Cette préparation de phages concentres a ete te-testee en ELISA. Les résultats, montrés à la figure 2, reproduisent l'ordre de reactivité observé dans la Fig. 2.

e) Sèquence de l'ADNc des fragments d'anticorps ScFv anti-α1 ,3GT
Les clones ScFv anti-α1 ,3GT sélectionnés ont été séquences pour s'assurer de la non introduction d'erreurs lors du sous-clonage par PCR et pour déterminer les associations chaîne lourde génomique-peptide alèatoire (de 4 à 12 acides aminés)-chaîne légère Vλ3 qui produisent un anticorps reactif à rencontre de l'α1 ,3GT. Sur les six séquences analysées, deux sont identiques (n° 2 et 6), et deux ne diffèrent que par deux acides aminés dans la partie CDR3 (n° 1 et 5). La séquence n° 3 présente un codon ambre (codon reconnu comme un stop traductionnel dans un système eucaryote, mais considéré comme une glutamine dans la souche E coh-TG1 supE utilisée pour le clonage) à la jonction CD3-peptide linker reliant les chaînes lourdes à la chaîne lègère Vλ3. Un codon stop à cette position est une consèquence prévisible de l'association aléatoire des fragments d'ADNc qui se produit lors de la fabrication de la banque ScFv. Le remplacement du nucléotide T en position 313 par un C permet d'obtenir un codon correspondant à une glutamine en position 105 (voir SEQ ID NO 13). Les chaînes lourdes (désignées séquences VH) sélectionnées ainsi que la séquence des régions CDR3 sont décrites dans le tableau 1; la séquence de clone ScFv1 correspond à la séquence reprèsentèe par SEQ ID NO

9, la séquence du clone ScFv2 et celle du clone ScFv6 correspondent à la sèquence reprèsentée par SEQ ID NO 11 , la sèquence du clone ScFv3 correspond à la séquence représentée par SEQ ID NO 13, la sèquence du clone ScFv4 correspond à la sèquence représentée par SEQ ID NO 15 et la sèquence du clone ScFv5 correspond à la séquence reprèsentèe par SEQ ID NO 17.


Séquences VH d'origine génomique et CDR3 des anticorps synthétiques spécifiques de l'α1 ,3GT porcine: Les séquences nucléotidiques des clones ScFv sélectionnés en ELISA pour leur affinité à rencontre de l'α1 ,3GT de porc ont été effectuées. Le tableau montre les séquences des troisièmes régions de complémentarité des anticorps (CDR3). La nomenclature des segments variables des chaînes lourdes en configuration germinale est celle utilisée dans Tomlinson èt al., 1992.

g) Evaluation de l'efficacité de l'immunisation intracellulaire
Les ADNc codant pour les anticorps anti-α1 ,3GT n° 1 à 6, natifs ou possédant les séquences signal et de localisation golgienne, ont été sous-clonés dans le vecteur d'expression eucaryote pCDAAS, sous le contrôle du promoteur de CMV. Pour tester la conséquence de l'expression des ScFv anti-α1 ,3GT sur la diminution de l'expression de l'épitope α-galactosyl sur la membrane des cellules de porc, des cellules LLC-PK1 ont été transfectées avec les différents plasmides pCDAAS-ScFv, et des clones ont été isolés. La présence de l'épitope xénoantigénique α-galactosyl a été évaluée en immunofluorescence avec la lectine IB4-FITC (spécifique du galactose branché en configuration α), en comparaison avec les mêmes cellules, non transfectées. Les résultats montrent que l 'anticorps ScFv n° 2 (à savoir celui représenté par SEQ ID NO 12) encodant la séquence VH DP-5, associée une partie CD3 artificielle composée des acides aminés PEIDQ, reliée à la séquence Vλ3, sans adjonction de séquences signal et de rétention golgienne, lorsqu'il est exprimé dans une cellule de porc, entraîne jusqu'à 95% de diminution de l'expression du galactose branché en configuration α. En effet, la fluorescence moyenne des cellules LLC-PK1 est de 465 unités lorsque le marquage est réalisé avec 20 μg/ml IB-4-FITC, et elle tombe à 49 unités pour le clone LLC-PK1 -ScFv6.

En conclusion, dans le contexte de la xénotransplantation, la possibilité d'inhiber dans une cellule de porc l'expression de l'α1 ,3GT en utilisant cette technique, conduit à des applications très claires : la disponibilité de porcs transgéniques n'exprimant pas ou peu d'épitopes α-galactosyl, conséquence de l 'inhibition de l'α1 ,3GT, et exprimant un inhibiteur du complément humain, comme cela existe déjà, permet d'effectuer des xénogreffes en évitant la réaction des cellules du greffon avec les anticorps et avec le complément du receveur humain.
Les résultats qui sont présentés ci-dessus, montrent que des cellules d'origine porcine exprimant un anticorps ScFv anti-α1 ,3GT peuvent être obtenues, et que cette expression résulte en une diminution importante du niveau de xénoépitopes exprimés

III - Anticorps monoclonaux anti-α1,3GT

La partie codante de l'α1 ,3GT, isoforme n° 2 a été sous-clonée par PCR dans le vecteur d'expression procaryote pQE30 (Quiagen), en fusion en 5' avec une queue de six histidines servant à la purification de la protéine recombinante sur une matrice chargée (Ni-NTA). Le clone ainsi obtenu a été entièrement séquence pour s'assurer de l'absence de mutations par rapport au clone de départ, qui auraient pu être introduites lors de l'amplification PCR. Le plasmide pQE30-α1,3GT a été introduit dans E. Coli M15 et la protéine recombinante produite in vitro par induction de la transcription à l'IPTG. Après purification, l'α1 ,3GT a été dialysée en PBS et injectée à une souris BALB/C à raison de 3 injections de 40 μg chacune tous les 15 jours. Les lymphocytes spléniques ont été collectés et fusionnés avec l'hybridome de souris SP2-O. La sélection des hybridomes sécrétant une immunoglobuline reconnaissant l'α1 ,3GT s'est effectuée par test ELISA: des plaques de microtitration ont été glacées avec 10microg/ml de protéine α1 ,3GT recombinante, 16h à 4°C à pH 9.5. puis saturées 2h, 37°C avec PBS-BSA1 % , Tween 20 0.5% . Les surnageants de hybridomes ont été incubés 1h, 37 °C et les anticorps immunoabsorbés révélés l 'aide d'un anti-Ig marqué à la peroxydase. Les hybridomes fournissant une densité optique au moins trois fois supérieure au bruit de fond ont été retenus.

IV - Clonage d'anticorps ScFv (Single chain Fv) à partir d' hybridomes

Le clonage de fragments d'immunoglobulines sous forme de fragments ScFv est décrit dans Clackson et al. (1991)). En bref, de l'ARN est préparé à partir de 5×108 cellules d'hybridome, et l'ARN messager est sélectionné sur oligo(dT)-cellulose. Un premier brin d'ADNc est synthétisé comme suit : 10μg d'ARNm sont incubés avec 20 pmoles des oligos VH1FOR ou VK1FOR

(Clackson et al., 1991), 250 μM de chaque dNTP, 10 m M DTT, 100 m M Tris.HCl (pH8.3), 10 mM MgCl2, et 140 mM KCI, 10 min. à 70°C, puis 1h à 42 °C en présence de 50 unités de Transcriptase Reverse. L'amplification par PCR des fragments VH et VL est réalisée en mélangeant 2 μl de réaction RT avec 25 pmoles des amorces VH1FOR ou VK1FOR, et VH1BACK ou

VK1BACK (Clackson et al.., 1991), 250 μM de chaque dNTP, 67 mM Tris.HCl (pH 8.8), 17 mM (NH4)2SO4, 10 mM MgCl2, et 2 unités de Taq polymérase, pour 30 cycles d'amplification. Les fragments obtenus sont alors purifiés et 1 μg de chaque sont mélangés avec 300 ng de linker (gly4Ser)3, et amplifiés par 7 cycles de PCR destinés à relier les fragments. Les fragments VH et VL reliés sont alors amplifiés en 20 cycles avec les oligos VH1BACK et VK4FOR. Les fragments obtenus sont alors ré-amplifiés avec les oligos VH1BACK-BamH1 et VK4FOR-BamH1, digérés par BamH1 et clones dans le vecteur d'expression eucaryote PCDAAS, sous le contrôle du promoteur CMV.

V -Voies d'action intracellulaire des anticorps anti-α1 ,3GT

Le mécanisme moléculaire par lequel un anticorps exprimé dans une cellule interfère avec la fonction d'une molécule portant le site antigénique contre lequel cet anticorps est exprimé n'est pas élucidé. Cependant, plusieurs explications ont été proposées. Dans le cas de l'inhibition de la reverse transcriptase de HIV (Maciejewski et al., 1995), l'anticorps anti-RT n'est pas neutralisant dans un test in vitro. Les auteurs proposent que le complexe antigène/anticorps formé dans la cellule puisse bloquer stériquement le mouvement de l'enzyme le long de la molécule d'ARN, ou bien puisse modifier sa structure secondaire. Dans le cas de l'inhibition de la chaîne α du récepteur à l 'IL-2 (Richardson et al., 1995), un processus de dégradation du complexe antigène/anticorps a été proposé. Ce processus semble non lysosomial, car la méthionine méthyl ester (un inhibiteur lysosomial) n'entraîne pas d'accumulation du complexe. La dégradation ne se produit pas non plus dans le compartiment Golgien car la brefeldin A (qui détruit le Golgi) est sans effet. La dégradation se produit donc précocement, sans doute au niveau du réticulum endoplasmique. Dans plusieurs cas où la localisation intracellulaire de la molécule cible conditionne sa fonction, il est possible que l'anticorps intracellulaire retienne cette molécule dans un compartiment qui lui est étranger. Richardson et al. ont en effet montré que l'expression d'un anticorps anti-RT, retenu dans le réticulum endoplasmique par incorporation d'une séquence de rétention KDEL, retient la RT dans ce compartiment.
Dans le cas de l'inhibition de l'α1 ,3GT par des anticorps ScFv, on peut supposer que : 1) soit les anticorps modulent l'activité de l'enzyme (par exemple en modifiant sa structure), 2) soit ils la retiennent dans un compartiment intracellulaire autre que le trans-Golgi (compartiment dans lequel le branchement de galactose en α1 ,3 sur le galactose du N-acélyllactosamine est effectué), 3) soit ils entraînent la dégradation du complexe antigène/anticorps par un mécanisme non élucidé. Il pourrait s'agir par exemple d'une ubiquitination suivie d'une dégradation par le complexe protéasome.

VI - Construction d'animaux transgéniques avec les ScFv proposés

L'obtention d'animaux transgéniques pour un ScFv anti-α1 ,3GT présente des intérêts en recherche et en clinique. Pour la recherche, la transgenèse chez le rat convient particulièrement car ses organes peuvent être greffés chez le singe, où ils subissent un rejet semblable au rejet de xénogreffe dans le modèle porc-primate Pour l'utilisation thérapeutique de greffons, le porc est l'animal de choix.

a) Transgenèse chez le rat :
Les embryons au stade unicellulaire sont obtenus à l'issue d'un protocole de super-ovulation appliqué à des rates de souche CD âgées de 28 à 38 jours (Amstrong et Opavoky, 1988). Ce protocole permet d'obtenir de façon régulière une moyenne de 40 à 50 embryons par femelle. La construction portant l'ADNc codant pour l'anticorps anti-α1 ,3GT (deux exemples de constructions pouvant être utilisées sont montrés sur les figures 4 et 5) est injectée à raison de quelques milliers de copies par embryon. Les embryons traités sont alors réimplantés dans la matrice. Les rats issus de ces embryons sont ensuite testés pour sèlectionner les animaux ayant effectivement incorpore dans leur génome l'ADN tiansgenique. Ces tests sont effectués au niveau de l'ADN et de l'ARN, que l'on peut dètecter par hybridation avec une sonde ADN correspondant au transgene, et au niveau protéique. La détection de la protéine ScFv peut être effectuée par leaction avec un anticorps anti Fab humain, ou par un anticorps anti-epitope, si l'ADNc ScFv est en fusion avec un ADNc codant pour un peptide portant cet epitope.

b) Transgenese chez le porc :
Des embryons fécondés au stade pronucleaire sont obtenus par laparotomie a partir des oviductes de truies matures âgées de 7 à 10 mois, 50 heures après l'induction de la superovulation et 20 à 26 heures après l 'insèmination. Le Pronucleus, dans lequel est injecté l'ADN, est visualise par une centrifugation de l'ovocyte à 15000 g pendant 3 minutes. Les résultats après réimplantation d'ovocytes traités de cette manière montrent que 10 % d'entre eux se développent et donnent un animal, et que 15 % d'entre eux ont incorpore l'ADN transgénique, soit 1,5 % des ovocytes traités Parmi ces animaux positifs quant a l'intègration d'ADN, 67 % expriment effectivement la protéine correspondant au transgène (White et al., 1994, Cozzi et White, 1995).

VII Etude de l'expression intracellulaire des sèquences nucléotidiques codant pour des anticorps anti-α1,3GT selon l'invention, sur la production de l'èpitope Galα1 ,3Gal

Une analyse des conséquences de l'expression intracellulaire des séquences nuclèotidiques codant pour des anticorps single chain (ScFv) anti-α1 ,3 galactosyltransférase porcine (α1 ,3GT), sur la production de l'épitope sucré Galα1,3Gal par des cellules porcines, a été effectuée au niveau de l'expression membranaire du sucre lui-même, et au niveau de l'activité enzymatique intracellulaire. L'analyse porte également sur les conséquences de la diminution de 1 expression de ce sucre sur la toxicité du sérum humain vis à vis des cellules poicines.
Dans le but d'étudier l'incidence de la valence de l'anticorps intracellulaire ScFv anti-α1 ,3GT sur le fonctionnement de cette enzyme, un anticorps ScFv a été di- et tetramerise, et testé in vitro dans des cellules de porc.

a) Etude de la diminution de l'expression de l'épitope Galα1,3Gal à la surface de cellules porcines LLC-PK1 exprimant des ScFv anti-α1 ,3GT.
Les séquences nucléotidiques indiquées dans la figure 6, ainsi qu'une séquence contrôle (codant pour un anticorps ScFv analogue mais ne reconnaissant pas l'α1 ,3GT), ont été clonées dans un vecteur d'expression eucaryote, sous le contrôle du promoteur du CMV. Des cellules porcines LLC-PK1 ont été transfectées avec ces vecteurs d'expression et des clones ont été dérivés. Les résultats de la figure 6 montrent une diminution significative de l'expression de l'expression du sucre Galα1,3GaI de l'ordre de 30 à 40 % .

b) Etude de la diminution de l'activité enzymatique α1 ,3GT dans les cellules porcines LLC-PK1 exprimant des ScFv anti-α1 ,3GT.
Des lysats cellulaires totaux provenant des clones de cellules porcines LLC-PK1 présentés à la figure 7 (exprimant des séquences codant pour des ScFv anti-α1 ,3GT, avec ou sans la séquence KDEL de rétention dans le réticulum endoplasmique) ont été analysés par une technique biochimique mesurant spécifiquement l'activité de l'enzyme α1 ,3GT (Cho et al. , 1996, J . Biol. Chem. 271:3238). Les résultats sont exprimés en moyennes +/- SD des pourcentages d'activité par rapport à celles obtenues à partir de cellules LLC-PK1 non transfectées. Ils montrent une diminution significative de l'activité enzymatique de l'ordre de 40 à 60 % lorsque des séquences ScFv anti-α1 ,3GT ScFv-1 ou ScFv-2, le cas échéant associées à la séquence codant KDEL, sont exprimées.

c) Etude de la diminution de la cytotoxicité du sérum humain à rencontre des cellules porcines LLC-PK1 exprimant des ScFv anti-α1,3GT.
Certains clones de cellules porcines LLC-PK1 présentés à la figure 8 (exprimant des séquences codant pour des ScFv anti-α1 ,3GT) ont été marqués au 51Cr puis incubés en présence de sérum humain contenant des xénoanticorps anti-Galα1 ,3Gal et du complément. Le relargage de 51Cr, comme estimation de la lyse cellulaire, a été mesuré. 100 % de lyse correspond à une lyse totale induite par un agent chimique, et 0 % de lyse correspond à une incubation avec le sérum décomplémenté. Les résultats montrent une diminution importante de la sensibilité à la lyse par le complément humain des clones exprimant les séquences SEQ ID NO 9 (ScFv-1) ou SEQ ID NO 11 (ScFv-2/6).

d) Etude de l'augmentation de la valence d'un ScFv anti-α1 ,3GT intracellulaire sur le fonctionnement de l'enzyme.
Cette augmentation a été testée par fusion des séquences de dimérisation et de tetramerisation zip et T-zip dérivées du facteur GCN4 (Pack et al. , 1995) à l'extrémité C-terminale de la séquence nucléotidique SEQ ID NO 11; les séquences résultantes sont désignées ScFv-zip et ScFv-tetrazip sur la figure 9.

Les constructions obtenues ont été sous-clonées dans le vecteur d'expression eucaryote pHook (Invitrogen) permettant l'identification en cytométrie de flux des cellules exprimant ces plasmides (car possédant une séquence codant pour un marqueur membranaire identifiable). Après transfection transitoire de cellules porcines LLC-PK1 avec la séquence SEQ ID NO 11 comportant une séquence de dimérisation (ScFv-zip), une diminution de l'expression de l'épitope

Galα1 ,3Gal de 31 % par rapport aux cellules de départ a été observée dans les cellules exprimant le vecteur. Dans les mêmes cellules transfectées avec la séquence SEQ ID NO 11 comportant une séquence de tetramerisation (ScFv-tetrazip), une diminution de l'expression de l'épitope Galα1 ,3Gal de 45 % par rapport aux cellules de départ a été observée.

En conclusion, l'expression dans des cellules de porc des séquences nucléotidiques SEQ ID NO 9 et SEQ ID NO 11 entraînent une diminution importante de l'activité enzymatique α1 ,3GT et une diminution significative de la présence du sucre GaIα1 ,3Gal à la surface des cellules. Cette diminution est suffisante pour entraîner une protection très importante vis à vis de la lyse induite par le complément humain. Ces résultats démontrent l'intérêt de l'expression des séquences ScFv anti-α1 ,3GT chez le porc dans une situation de xénogreffe porc-homme. L'augmentation de la valence de l'anticorps intracellulaire codé par la séquence SEQ ID NO 11 entraîne une augmentation de son efficacité inhibitrice.

Légendes des figures :

- Figure 1 :
Analyse des séquences des transcripts des isoformes de l'α1 ,3GT de porc, et alignement sur une carte de transcript primaire murine. Les ADNc des isoformes 1 , 3 et 4 ont été clones à partir d'ARNm rétrotranscripts et amplifiés par PCR provenant de PAEC et l'ADNc correspondant à l 'isoforme 2 a été clone à partir d'une banque LLC-pK1 , comme décrit ci-dessus. La séquence nucléotidique a été déterminée par utilisation de Séquenase (USB), et comparée par contrôle avec les séquences correspondant aux isoformes 1 et 2 décrites par

Strahan et al., 1995 et Sandrin et al., 1994. Les numéros en gras sur le côté gauche de la figure correspondant aux isoformes 1 à 4. Les premières bases des exons 5, 6 et 7 sont numérotées sur la séquence correspondant à l'isoforme 1 . Les chiffres représentés en italique indiquent le nombre de bases manquantes dans l'exon épissé correspondant. La carte primaire de transcription de la souris avec ses 9 exons, telle que décrite par Joziasse et al., 1992, est comparée avec les séquences des isoformes 1 à 4.
La queue cytoplasmique (encadré noir) et la région transmembranaire (encadré avec lignes verticales) sont codées par l'exon 4. Les régions d'origine (encadré grise) comprend les exons 5 et 6. Les exons 5 et 6 sont épissés alternativement chez la souris et le porc. Le domaine catalytique est codé par les exons 7, 8 et 9.

- Figure 2 :
Réactivité mesurée par ELISA de préparations non purifiées de phages correspondant à 15 clones reconnaissant la protéine α1 ,3GT: Quatre vingt seize colonies individuelles de bactéries TG1 contenant un clone pHEN-1-ScFv, présélectionnées par une procédure d'enrichissement décrite dans Nissim et al., 1994, ont été cultivées et leur surnageant (contenant les phages exprimant l'anticorps) testé en ELISA comme décrit dans Matériels et Méthodes ci-dessus.

Les 15 surnageants positifs (numérotés 1 à 15) sont représentés en abscisse sur la figure. Le contrôle négatif (-) est constitué d'un blanc et le contrôle positif ( +) par la mesure de la densité optique obtenue par la réaction d'un phage M13 (Pharmacia) sur une lgG de souris anti-phage M13 (Pharmacia) déposée sur la plaque. Les valeurs de densité optique (DO) sont indiquées en ordonnée.

- Figure 3 :
Réactivité mesurée par ELISA de phages purifiés correspondant à 6 clones reconnaissant la protéine α1 ,3GT: Les six clones les plus positifs dans l'ELISA ci-dessus (Fig.2) ont été amplifiés en vue de la préparation de phages purifiés. Les phages purifiés et concentrés ont été re-testés en ELISA, de manière similaire à ce qui est décrit dans la figure 2. Ces phages ont été testés à une dilution de 1 à 1/8. Les dilutions effectuées sont représentées en abscisse, et la densité optique (DO) mesurée est indiquée en ordonnée, la courbe correspondant au contrôle positif passe par des points représentés par des croix, celle correspondant au phage contenant ScFv1 (M13-ScFv1) passe par des points représentés par un point noir au centre de carrés blancs, celle correspondant au phage contenant ScFv2 (M13-ScFv2) passe par des points représentés par des losanges noirs, celle correspondant au phage contenant ScFv3 (M13-ScFv3) passe par des points représentés par des points représentés par un point blanc au centre de carrés noirs, celle correspondant au phage contenant ScFv4 (M13- ScFv4) passe par des points représentés par des losanges blancs, celle correspondant au phage contenant ScFv5 (M13-ScFv5) passe par des points représentés par des carrés noirs, celle correspondant au phage contenant ScFv6 (M 13-ScFv6) passe par des points représentés par des carrés blancs, le blanc étant représenté par un rond noir.

- Figure 4 :
Cet exemple de construction consiste en l'utilisation du promoteur du CMH-1 de souris H-2Kb, permettant l'insertion du transgène (ADNc ScFv ; 0,7Kb) entre la partie promotrice proprement dite (promoteur H-2kb ; 4Kb) et une série d'introns/exons (5,5 Kb) appartenant au gène H-2Kb, cette série étant suivie par pA SV40 de 0,3 Kb. Ces introns contiennent des séquences régulatrices permettant d'obtenir une bonne activité du promoteur, et donc une bonne expression du transgène. Le promoteur H-2Kb permet une expression constitutive et ubiquitaire de l'ADNc dont il contrôle l'expression (Kimura et al., 1986; Byrne et al., 1995).

- Figure 5 :
Cet exemple de construction consiste en l'utilisation du minigène DAF (Cozzi et al., 1996), dont l'efficacité a déjà été démontrée en transgenèse chez le porc. De manière analogue à la construction H-2Kb, ce minigène place l'ADNc

ScFv (0,7 Kb) sous le contrôle du promoteur du DAF, lui-même contrôlé par des sèquences introniques (l'ensemble constitué par le promoteur DAF, les exons et les introns représentant 4,6 Kb), l'ADNc ScFv ètant suivie par pA SV40 de 0,3 Kb.

- Figure 6
Cette figure représente l'analyse en cytométrie de flux (FACscan) de la reconnaissance des épitopes Ga1α1 ,3Gal par la lectine IB4-FITC, en comparaison avec des cellules LLC-PK1 non transfectèes Les rèsultats sont des pourcentages moyens +/- SD de fluorescence par rapport à la fluoiescenee obtenue a partir des LLC-PK1 non transfectèes n : nombre de clones indèpendants analysés par groupe, ScFv-neg : cellules LLC-PK1 non tiansfectees, ScFv-1 cellules LLC-PK1 transfectèes avec le clone ScFv-1; ScFv-2/6 : cellules LLC-PK1 transfectées avec le clone ScFv-2 ou ScFv-6; les pourcentages de fluorescence sont indiques en ordonnée.

- Figure 7
Mesure de l'activité α1 ,3GT dans les cellules porcines LLC-PK1 transfectèes avec le clone ScFv-1 , ou ScFv-2, avec ou sans la sèquence KDEL de letention dans le rèticulum endoplasmique n nombre de clones indèpendants analysés par groupe, ScFv-neg cellules LLC PKI non tiansfectees, ScFv-1 cellules LLC-PK1 transfectées avec le clone ScFv- 1; ScFv-2 cellules LLC-PK1 transfectées avec le clone ScFv-2, ScFv- 1 KDEL : cellules LLC-PK1 transfectées avec le clone ScFv-1 et contenant la sèquence codant KDEL, ScFv-2KDEL cellules LLC-PK1 transfectèes avec le clone ScFv 2 et contenant la séquence codant KDEL, les pourcentages d'activitè α

1 ,3G1 sont indiqués en ordonnée

Figure 8
Mesure de la lyse par le complément des cellules LLC-PK1 transfectèes ou non avec des séquences ScFv anti-α1,3GT, et incubées avec du sèrum humain contenant des xenoanticorps naturels les dilutions de sérum sont indiquèes en abscisse, et le pourcentage de cytotoxicité en ordonnèe (moyenne de deux expenences indèpendantes), carrés creux cellules LLC-PK1 non transfectèes. carrés pleins cellules LLC-PK1 transfectées avec un plasmide contrôle, cercles creux cellules LLC-PK1 exprimant le ScFv correspondant à la séquence SEQ

ID NO 9 (clone 1.7-7), cercles pleins cellules LLC-PK1 exprimant le ScFv correspondant à la sèquence SEQ ID NO 11 (clone 2 6-2) - Figure 9 :
Mesure de l'augmentation de la valence d'un ScFv anti-α1 ,3GT intracellulaire sur le fonctionnement de l'enzyme. L'intensité de fluorescence est indiquée en ordonnée (unités arbitraires); LLC-PK1 : cellules LLC-PK1 non transfectées; ScFv-neg : cellules LLC-PK1 transfectées avec un plasmide de contrôle ne contenant pas de séquence ScFv; ScFv2zip : cellules LLC-PK1 transfectées avec la séquence SEQ ID NO 11 comportant une séquence de dimérisation (ScFv-zip); ScFv2tetrazip : cellules LLC-PK1 transfectées avec la séquence SEQ ID NO 11 comportant une séquence de tetramerisation (ScFv-tetrazip).

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